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免疫组化成功的经验和失败的教训汇总

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发表时间:2020-08-17 14:38作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

免疫组化成功的经验和失败的教训汇总

1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象?
一般来说,如果用多聚赖氨酸包被过的片子做正常免疫组织化学染色的话是不会掉片子的。但如果要做抗原修复的话,如果片子处理不好的话是有可能掉片子的。你可以试试一下的方法:
a.我们一般用APES:丙酮=1:50的处理液来处理片子,处理5min左右,然后水洗,烘干既可用于贴片。如果把水滴再处理好的片子上,水比较聚的话说明片子处理的好。
b.贴片子的时候,展片的时间要把握好,不要太长,否则不利于贴牢。
c.烤片子也很重要,切好的片子最好先不要马上收起来,而是水平至于烘片台上37度两个小时以上,一是水分彻底烘干。然后做染色前最好再在60度烘箱烘1个小时。
d.再补充一点 ,石蜡包埋时,酒精梯度脱水以及浸蜡等一点要充分,这对贴片也有影响。

2. DAB显色后发现切片着色不均匀:如一片着色,一片不着色或染色浅?
着色不均匀可能与你的实验手法有很大关系,可能原因有:
a.切出的片子厚度本身可能就不一样,切出一片厚,一片薄,这样可能造成着色深浅不一。
b.有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀,造成局部底物浓度不一致,所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下,使片子上所有区域的底物浓度一致。
c.如果你的片子是中间的染色深,靠近边上的浅,那有可能是你蜡圈画的太小,显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。

3. 免疫组化结果老是出现阴性结果?
免疫组化出现阴性结果有可能组织本身就没有信号,也有可能是抗体出了问题。你可以找一些阳性组织做一下,以确定是抗体的问题还是组织本身就没有所检测的抗原表达。还有,你可以提高抗体的浓度,或者试一试抗原修复等方法,也许会得到意想不到的结果。

4. 切片染色后背景太深,不易区分特异性与非特异性着色?
a.也许是抗体本身有问题,因为有很多公司的抗体质量并不好,很容易上背景,可以换一种抗体 试试。
b.如果经费不允许换抗体的话,你可降低抗体的浓度,并随时注意观察显色,在能看到信号的情况下尽量降低背景。
c.可以换一种封闭液,不同的封闭液对某种来源的抗体来说,会有不同的封闭效果。
d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所检测动物组织的正常血清,这样可以去除一部分非特异性染色。

5. 一抗从4度拿出后,为什么有人说要37度复温,目的是什么?
关于这个问题,我没有试过,我个人认为是没有必要的。但既然有人提出来,你可以试一试,看看复不复温有没有区别。

6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么?尤其是微波修复。
关于抗原修复,我个人的观点和panther75有点不同。我试过的修复条件有EDTA热修复,柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果来看,微波修复其实很不容易掉片子的,而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起,而微波修复水加热到沸腾,沾在片子上的气泡就会少,不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时,你可以将片子靠的尽量近些,或是在载玻片四周垫些棉花什么的,然后盖上盖玻片,这样修复的话就能够尽量减少载玻片上小气泡的形成。
我们用的微波修复条件为:
2.94g柠檬酸三钠溶于1000ml的水,调ph值至6.0,微波修复10分钟。你可以试试,时间可以根据需要自己调整。

7. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞,对石蜡切片需要否?
用石蜡切片做免疫组化是不需要透膜处理的,一是因为石蜡切片比较薄,另外一个原因我认为是在包埋过程中细胞膜已经被破坏,所以这一步可以省略。

8. 苏木素复染的时间应该是多少?复染过度咋办?
复染时间不需要太长,当然这也要根据苏木精的质量来确定,但基本上不要超多一分钟。染色过深的话可以用酸性的水溶液(在水里滴加少量浓盐酸)分色,分色的另外一个目的是洗掉苏木精在细胞质中的非特异性结合,这样可以使细胞质中的特异信号更明显。所以不管复染是不是过度,分色这一步最好不要省掉。分色后记得再用氨水返蓝一下。

9. 抗原修复应在灭活POD之前还是之后?

我想热修复后不需要灭活POD.


文章分类: 抗体技术资料
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