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将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜

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发表时间:2019-07-17 14:09作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜

电泳完毕后,可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜,有以下几种转移方法:毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗脱法如下所述, 真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必(Thomas,1980)甚至有害(Thomas,1983),
但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次,除去甲醛。 如果琼脂糖中浓度大于1%或凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/L氢氧化纳浸泡凝胶20分钟。 然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙膜,RNA随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
     1)将凝胶移至一个玻璃皿内,用锋利刀片修凝胶的无用部分,在凝胶左上角(加样孔一端为上)切去一角,以作为下列操作过程中凝胶方位的标记。
     2)用长和宽均大于凝胶的一块Plexiglas有机玻璃或一叠玻璃板作为平台,将其放入大千烤皿内,上面放一张Whatman 3MM滤纸,倒入20xSSC使液面略低于平台表面,当平上方的3MM滤纸温透后,用玻棒赶出所有的气泡。
     3)用一把新的解剖刀或切纸刀裁一张硝酸纤维素滤膜(Schleicher &Schuell BA85或与之相当的产品)。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大1mm, 接触滤膜时须戴手套或用平头镊子(例如Millipore镊子),用有油腻的手接触过的硝酸纤维素滤膜不易浸温。
    4)将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面,直至滤膜从下向上湿透为止,随后用20xSSC浸泡滤膜至少5分钟,用干净的解剖刀片切去滤膜一角, 使其与凝胶的切角相对应。不同批号的硝酸纤维膜,其浸湿速率相差悬殊。如滤膜池浮在水面上几分钟后仍未湿透,应另换一张新滤膜,因为未均匀浸湿的滤膜进行RNA转移是靠不住的。这种滤膜也不必丢弃,可将其夹在用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间, 高压5分钟。通常上述处理足以使硝酸纤维素滤膜湿透。高压处理的滤膜应夹在经过高压理理并用2xSSC浸湿的3MM滤纸中间,装入塑料袋, 密封后于4℃保存备用。
    5)将凝胶翻转后置于平台上温润的3MM滤纸中央,3MM滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。
    6)用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边,但不是覆盖凝胶, 以此作为屏障,阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾,易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触,这种液流的短路是导致凝胶中的RNA的转移效率下降的主要原因。
    7)在凝胶上方放置温润的硝酸纤维素滤膜,并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后,就不应轻易移动,滤膜与凝交之间不应留有气泡。
    8)用2xSSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸, 温润的放置在湿润的硝酸纤维滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。
    9)切一叠(5-8cm高)略小于3MM滤纸的纸巾,将其放置在3MM滤纸的上方。并在纸巾上方放一块越境玻璃板,然后用-500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路,以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。
   10)使上述RNA转移持续进行6-18小时,每当纸巾浸湿后,应换凝的纸巾。
   11)转移结束后,揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸,翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜,以凝胶的一面在上,置于一张干的3MM滤约纸上,用一支极软铅笔或圆珠笔,在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。
   12)从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以6x SSC溶液于室温浸泡滤膜5分钟,这一步可以除去粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。从6xSSC溶液中取出滤膜,将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸巾上。于室温晾干30分钟以上。为估计RNA的转移效率, 可将胶置于溴化乙锭溶液(0. 5 μg/ml , 以0.1mol/L乙酸铵配制)中染色45分钟,于紫外灯下观察。
13)将晾干的滤膜放在两经张3MM滤纸中间,用真空炉于80℃干烤0.5-2 小时。如干烤时间过长,滤膜极易脆裂并可能发黄。如果滤膜并不立即用于杂交实验,可用铝箔宽松地包裹起来,在真空下贮存于室温。
14)仅适用于滤膜上含有乙醛酰PNA的情况:杂交前需用20mmol/L Tris.Cl(pH8.0)于65℃洗膜,除去RNA上的乙二醛分子。


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