微生物-肠-脑轴的重要性已被越来越多地认为是自身免疫的主要调节剂。在这里，我们旨在表征一大批未接受过治疗的抗N-甲基-D人群的肠道菌群-天冬氨酸受体（抗NMDAR）脑炎患者相对于健康对照者（HCs）。相对于HCs，抗NMDAR脑炎患者的微生物组α多样性指数降低，肠道微生物组成明显紊乱，肠道通透性受损。抗NMDAR脑炎患者的微生物群紊乱可能与不同的临床特征有关。估算的KEGG分析显示抗NMDAR脑炎的肠道微生物区系中的功能模块受到干扰。与HCs相比，从抗NMDAR脑炎患者接受粪便微生物菌群移植（FMT）的微生物菌群耗尽的小鼠具有超敏反应和认知障碍。此外，抗NMDAR脑炎FMT小鼠的脾脏和小肠固有层T细胞改变，Th17细胞增加。总体，这项研究首先表明，抗NMDAR脑炎微生物组本身可以影响神经系统，Th17反应和行为功能。肠道菌群是抗NMDAR脑炎的潜在治疗靶标。
脑炎是一种由脑实质发炎引起的神经系统疾病，估计每年每100,000人中有5-10人发病，尽管这种发病率可能被低估了1。尽管脑炎最常归因于潜在的病毒感染，但自身免疫性疾病已日益被人们视为引起脑炎的原因2。自身免疫性脑炎（AIE）与主要针对突触受体（包括N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR），α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPAR）和γ-氨基丁酸B受体（GABAbR）。据报道，抗NMDAR脑炎是抗体相关性脑炎的最常见类型。尽管恶性肿瘤和感染被认为是引发抗NMDAR脑炎的诱因，但环境因素可能是免疫相关疾病风险的重要组成部分。
在过去的几年中，一系列研究支持了肠道菌群在神经系统疾病的发病机理中的作用3。2012年，Varrin-Doyer等4。他发现AQP4 p63–76与肠道微生物- 产气荚膜梭菌的三磷酸腺苷结合盒（ABC）转运蛋白的aaaa 204–217具有高度同源性。这一发现为中枢神经系统（CNS）自身免疫的发展提供了胃肠道菌群和分子模拟之间的可能联系。此外，最近的证据表明，肠道菌群可以通过“菌群-肠脑”（MGB）轴调节大脑功能和行为5。例如，据报道肠道菌群与焦虑6，记忆7，认知8和活动过度9有关。这些发现突显了肠道微生物群或MGB轴紊乱可能导致中枢神经系统自身免疫性疾病和神经精神病学症状发作的新可能性。
然而，针对抗NMDAR脑炎的MGB轴和自身免疫性研究相对较少。最近的一项临床研究表明，相对于一小群未接受过治疗的患者，抗NMDAR脑炎患者的粪便微生物群组成发生了显着变化10。新兴的动物研究表明，出生后没有肠道菌群的小鼠的NMDARs 11水平降低，表明肠道微生物组和NMDARs之间可能存在联系。在过去的十年中，已经获得了大量证据，表明肠道微生物组可以调节大脑功能，包括与焦虑和抑郁相关的行为12。此外，约80％的抗NMDAR脑炎患者会出现明显的精神和行为症状以及记忆功能障碍13，包括焦虑，烦躁，听觉或视觉幻觉，性抑制，躁狂，认知障碍和精神病。上述研究表明，肠道微生物组营养不良可能与抗NMDAR脑炎和神经精神病学表现有关。同时，在抗NMDAR脑炎中，肠道微生物组介导的免疫应答是未知的。
为了解决这个问题，我们采用了基于16S核糖体RNA（16S rRNA）基因测序的方法，比较了抗NMDAR脑炎患者和健康对照（HCs）患者的肠道微生物群落，以评估肠道菌群营养不良是否与抗微生物药物相关。 NMDAR脑炎进展。为了验证肠粘膜屏障功能障碍，脂多糖（LPS）水平，血清D-乳酸（D还通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测了肠通透性损伤的标志物-Lac）和二胺氧化酶（DAO）。然后，我们将抗NMDAR脑炎患者的粪便微生物菌群移植（FMT）植入到了耗竭微生物群的小鼠中，以测试抗NMDAR脑炎相关的行为表型是否可以通过肠道菌群传播。进一步的研究表明，与HC FMT小鼠相比，抗NMDAR脑炎FMT小鼠增加了Th17细胞。
我们在一个大型且特征明确的队列中研究了粪便微生物群，该队列包括54位新诊断的抗NMDAR脑炎患者以及54位年龄，性别和体重指数（BMI）匹配的HCs。排除了接受抗生素治疗或数据丢失的十四名患者。最后，纳入了40例抗NMDAR脑炎患者和54例HC，以进行进一步分析。所有入选患者均在常规治疗前提供了粪便样本。如表1所示，抗NMDAR脑炎患者（女性：男性= 22:18）与HCs（女性：男性= 30:24）相当，抗NMDAR脑炎患者中位年龄为22.00岁，HCs中位年龄为23.00岁。在40例抗NMDAR脑炎患者中，有32例表现为PCS（简短精神病评定量表（BPRS）> 35），6例肿瘤和15例癫痫发作。
总的来说，我们在所有样本中获得了3,993,993个高质量读段，平均长度为439.18 bp。这些读段以与Greengene Database的97％序列相似性聚类为7096个操作分类单位（OTU）。最后，将7096个合格的操作分类单位（OTU）聚在一起进行下游分析。维恩图显示，在两组中共检测到7036个OTU中的3536个，而798和2738个OTU分别是抗NMDAR脑炎和HCs患者所特有的（图S1D）。阿尔法多样性分析表明，按照Chao1，观察物种，ACE，香农和Simpson指数的测量，抗NMDAR脑炎与个体内物种多样性的降低密切相关（图1a和S1A，C）。
a与对照组相比，抗NMDAR脑炎患者的观察到的OTU和Shannon多样性指数值显着降低。b对Bray-Curtis异同性的主要坐标分析表明，抗NMDAR脑炎的个体与健康对照显着不同（伪F：4.29，p <0.001）。c抗NMDAR脑炎患者（红色）和健康对照（绿色）中不同分类学组成的重排图。d LDA评分显示抗NMDAR脑炎患者（红色）和健康对照（绿色）之间存在明显的细菌差异。受试者工作特征分析表明，该组合ë50个微生物标记物（包括未识别的微生物的组分）和˚F 10识别的属可以区分患者抗NMDAR从碳氢化合物脑炎与分别0.97和0.77，的AUC。（* p <0.05，*** p <0.001，通过Mann–Whitney U检验）。
为了评估肠道微生物组组成的总体多样性，我们基于Bray-Curtis不相似性进行了主坐标分析（PCoA）（伪F：4.29，p <0.001，图1b）。两组之间的微生物群落也有显着差异，如加权UniFrac距离（伪F：7.36，p <0.001，图S1E）和未加权UniFrac距离（伪F：2.88，p <0.001，图S1F）所测量。）。
为了识别差异丰富的分类单元，我们对两组的粪便微生物群组成进行了线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析。在抗NMDAR脑炎患者和HCs中，拟杆菌和纤毛虫是两个最主要的门（图1c和S2A）。此外，在门静脉水平上，抗NMDAR脑炎患者的细菌变形杆菌比HCs丰富，而Ficerticutes的丰度在HCs中更高（图1d）。在属的水平，拟杆菌，普氏菌，Faecalibacterium，罗斯氏和两组中副细菌类均占肠道菌群的主导（图S2B）。两组之间有31个细菌分类单元显示出相对的相对丰度（LDA得分> 2.0，p <0.05）。这些属中的十六个的丰度显着不同。降低细菌如丰度Faecalibacterium，罗斯氏，Lachnospira，瘤胃球菌属，Dialister，Coprococcus，柯林斯，和厌氧和增加的丰度杆菌，肠球菌，大肠杆菌，韦荣球菌，链球菌，Dorea，Scardovia和梭状芽孢杆菌中观察到的抗NMDAR脑炎观察相对于碳氢化合物的患者。
接下来，我们评估了使用肠道菌群作为生物标记物的潜在价值。基于40名患者和54名对照中的50种微生物标记物，基于不同肠道微生物的相对丰度构建了Logistic回归分析（P <0.01，表S2）。接受者操作特征（ROC）分析表明，这种微生物检测小组（包括未确定的微生物组成分）能够区分抗NMDAR脑炎患者的HCs，曲线下面积（AUC）为0.97（95％CI：0.95– 1.00）（图1e），证实基于肠道微生物组的分类器能够准确区分抗NMDAR脑炎患者与对照组。但是，将需要对另一组患者进行分析以测试该模型。此外，另一微生物面板，其包括10识别的属的ROC分析，不动杆菌属，厌氧，Anaerotruncus，梭菌属，Dialister，肠球菌，Pseudoramibacter，瘤胃球菌属，链球菌属和韦荣球菌，产生了仅0.77的AUC（95％CI：0.68-0.87）（图1f），提示16S rRNA基因测序存在局限性（P <0.01，表S1）。
为了确定抗NMDAR脑炎患者的微生物群是否可能与不同的临床特征有关，我们将患者分为精神症状（PCS）或非PCS亚组，癫痫或非癫痫亚组以及肿瘤或非肿瘤亚组。物种的丰度寡妇蛛属indistinctus和产气荚膜梭菌和属Alistipes在PCS子组的含量较高，而属Mitsuokella，Lachnospira和韦荣球菌是在非PCS子组更丰富。（P ＜0.05，LDA评分＞ 2；图2a和S3A）。只有家庭真细菌科和属YRC22和Pseudoramibacter分别在亚组癫痫比在非癫痫组（更丰富的P <0.05，LDA评分> 2.5;图2B和S3B）。有4个科，2个类，13个属，5个科和1个物种，它们在肿瘤和非肿瘤亚组之间具有相对不同的相对丰度（P <0.05，LDA得分> 2；图2c和S3C）。
一个 LDA的分数表示PCS子组（红色）之间的和非PCS子组（绿色）显著细菌的差异。b LDA评分显示癫痫亚组（红色）和非癫痫亚组之间存在明显的细菌差异。cLDA得分显示出肿瘤亚组（红色）和非肿瘤亚组（绿色）之间的显着细菌差异。
由于在抗NMDAR脑炎患者的微生物组中观察到肠道营养不良，因此确定了抗NMDAR脑炎患者和HCs的肠粘膜功能。相对于HC水平，在抗NMDAR脑炎患者中观察到D- lac，DAO和LPS 明显增加（p <0.0001）（图3a，c）。D的平均浓度抗NMDAR脑炎患者的-Lac，DAO和LPS分别为1.003 mmol / L，4.632 ng / mL和1.415 ng / mL，而HCs中的D-Lac，DAO和LPS的平均浓度为0.619 mmol / L ，3.112 ng / mL和1.071 ng / mL。当我们进一步将这些患者分为PCS和非PCS亚组，肿瘤和非肿瘤亚组，癫痫和非癫痫亚组并进行亚组比较时，没有发现显着差异（图S5）。我们还评估了肠粘膜功能和BPRS与10个不同属的关联（图3d）。DAO与不动杆菌，假单歧杆菌和韦永氏菌呈正相关丰度，而LPS与梭菌和假单胞菌丰度呈正相关（P <0.05）。此外，D- Lac与链球菌和厌氧消化菌的丰度呈正相关，而与Dialister和厌氧菌的丰度呈负相关（P <0.05）。在BPRS与差异属的丰度之间未发现显着关联。
抗NMDAR脑炎和HC受试者的血清D-Lac浓度。b抗NMDAR脑炎患者和HCs的血清LPS浓度。c抗NMDAR脑炎患者和HCs的血清D-Lac浓度。d在肠道通透性损伤标记物的浓度，BPRS和差异丰富属的丰度之间计算Spearman等级相关系数。（ 根据Mann-Whitney U检验，a – c **** p <0.0001 ）。
为了研究抗NMDAR脑炎患者和HCs之间微生物群落的功能和代谢变化，我们接下来从16S rRNA数据推断出元基因组，并使用通过未观察到的国家重建进行的系统进化研究来分析肠道菌群的功能潜力。 PICRUSt）。LEfSe分析确定了68种京都基因和基因组百科全书（KEGG），在抗NMDAR脑炎患者（n = 40）和HCs（n = 54）之间存在显着差异的丰度（LDA得分> 2.0，p <0.05）（图。4）。值得注意的是，我们发现与果糖和甘露糖代谢有关的功能模块已显着改变。此外，相对于HCs，LPS生物合成蛋白在抗NMDAR脑炎患者的微生物组中似乎过分表达，这与血清中LPS含量的增加是一致的。通过诱导促炎性细胞因子，增加的LPS生物合成可以使抗体在抗NMDAR脑炎中进入大脑。此外，多种氨基酸代谢被改变。例如，抗NMDAR脑炎患者的微生物组中色氨酸代谢增加。谷胱甘肽代谢在抗NMDAR脑炎微生物组中也高度丰富。
KEGG模块的条形图在抗NMDAR脑炎患者和HCs之间有显着差异。
为了确定抗NMDAR脑炎患者肠道菌群是否与相关的行为表型相关，我们进行了FMT实验（图5a）。随机选择用于这些FMT实验的肠道菌群样品。在高迷迷宫测试中，抗NMDAR脑炎FMT小鼠和HC FMT小鼠在张开双臂中的进入时间和时间没有差异，但相对于NMDAR脑炎FMT小鼠，其距离和速度显着增加。 HC FMT小鼠（图5b和S4A，D），表明活动过度，并且没有抑郁样行为。同样，抗NMDAR脑炎微生物群受体小鼠表现出活动过度（总距离和平均速度增加;图。在开场试验中，图5d，e）没有焦虑（在中心区域花费的时间与HC小鼠无显着性差异；图5c）（图S4E）。使用莫里斯水迷宫测试和新颖的物体识别来测量认知行为。与HC FMT小鼠相比，抗NMDAR脑炎FMT小鼠在新颖的物体识别测试中显示出较低的辨别率和较低的辨别指数（图S4G，H），更高的速度和更大的总距离（图S4F，G）。 （图5f），表明记忆学习缺陷和过度活跃。在莫里斯水迷宫测试中，抗NMDAR脑炎FMT小鼠的平台位置交叉点显着少于HC FMT小鼠（图2）。5h，i），表示空间和记忆学习不足受损。在测试中，抗NMDAR脑炎FMT小鼠也表现出活动过度（距离和平均速度增加；图S4I，J）。总的来说，这四个行为测试表明，抗NMDAR脑炎FMT小鼠没有表现出焦虑和抑郁样的行为，但表现出过度活跃和认知行为不足，这表明抗NMDAR脑炎FMT小鼠的微生物组成受干扰可能与行为特征有关。在抗NMDAR脑炎患者中。
a此行为研究的工作流程图。b高架迷宫测试。在HC FMT小鼠和抗NMDAR脑炎小鼠之间未观察到显着差异。c – e野外测试。HC菌群受体小鼠和抗NMDAR脑炎FMT小鼠之间的时间在中心区域没有显着差异，但是抗NMDAR脑炎FMT小鼠的总距离，平均总距离和速度显着增加。f，g新型物体识别测试。相对于HC FMT小鼠，抗NMDAR脑炎FMT小鼠的辨别率降低。^ h，我莫里斯水迷宫测试。抗NMDAR脑炎FMT小鼠的平台位置交叉点明显少于HC FMT小鼠。每个点代表一只小鼠，实验重复至少两次，结果相似。（* P <0.05，使用非参数检验）。
肠道菌群被认为可以直接影响肠道固有层14中的免疫细胞。产生IL-17的T细胞和Treg通常位于肠道固有层15中。为了确定抗NMDAR脑炎患者肠道菌群是否可能与免疫反应有关，从脾脏和小肠固有层（SI LP）分离淋巴细胞，并检测Th17和Treg细胞的水平。与HC FMT小鼠相比，抗NMDAR脑炎FMT小鼠脾脏和SI LP的促炎性Th17细胞（IL-17A + CD4 +阳性）升高（图6a）。但是，Treg细胞（Foxp + CD4 +两组之间均检测到阳性）（图6b）。这些结果表明，来自抗NMDAR脑炎患者的肠道菌群可特异性增强Th17反应，而不会影响Treg细胞的百分比。
a。对TCRβ+ CD4 +进行门控的IL-17A + CD4 T细胞亚群的代表性染色以及脾脏和SI LP百分比的统计分析。b FOXP3 + CD4 T细胞亚群的代表性染色以及对TCRβ+ CD4 +门控的脾脏和SI LP百分比的统计分析。每个点代表一只老鼠，这是在每个实验中执行相似结果的三个不同实验之一。（* P <0.05，*** P <0.001，使用非参数检验）。
肠道菌群可以通过MGB轴线影响脑功能，行为和神经免疫调节，进而可能使各种神经免疫疾病的发作16，17。在本文中，我们首先通过16S rRNA基因测序在新诊断的大型NMDAR脑炎队列中描述了粪便微生物群的群落结构。我们的数据表明，抗NMDAR脑炎的特点是细菌多样性降低，相对丰度改变和肠粘膜屏障功能障碍。最值得注意的发现是与NMDAR脑炎相关的行为表型可通过其肠道菌群传播。此外，肠道菌群本身也可以通过增加Th17细胞来调节免疫反应。
通常，高度多样性被认为是健康状况的标志。低细菌多样性经常在各种疾病中得到记录，被认为是肠道营养不良的主要类型之一18。如结果所示，与HCs相比，抗NMDAR脑炎患者的粪便微生物组表现出降低的物种丰富度和多样性。而且，抗NMDAR脑炎患者的微生物组成与HCs明显不同。该门厚壁菌门是碳氢化合物更加丰富，而更大数量的变形菌中发现抗NMDAR脑炎患者，这是按照我们的视神经脊髓炎谱系障碍（NMOSDs）以前的实验室研究19。值得注意的是，我们观察到在各种短链脂肪酸（SCFA）产生的细菌，如降低Faecalibacterium，罗斯氏，Lachnospira，瘤胃球菌属，和Coprococcus。由膳食纤维发酵产生的短链脂肪酸已知通过抗炎作用对健康产生有益的作用20。通过微生物群减少SCFA的产生增加了对肠屏障21的破坏。在验证肠粘膜损伤中，在抗NMDAR脑炎患者中观察到D- Lac和DAO 大量增加，在肠屏障破坏期间血清中的化学标记通常较高22。因此，有益细菌的抗炎代谢产物缺乏保护以及肠道通透性异常在抗NMDAR脑炎的发病机理中也起着关键作用。值得注意的是，链球菌属，以前一直是与NMOSDs最密切联系的分类群，也显示出与抗NMDAR脑炎和D-Lac 19的相关性，表明它与肠粘膜损害有关。
尽管可以在脑脊液中检测到NMDAR抗体（敏感性和特异性均为100％），但检测血清中的抗体的敏感性和特异性较低，其中误诊率为13％23。在本研究中，由50种OTU标记物组成的模型（包括未确定的微生物组成分）能够以较高的准确度将抗NMDAR脑炎患者与HCs准确区分开（AUC = 0.97）。而且，包括10个已鉴定属的组合的另一个微生物组的AUC仅为0.77。未知的微生物组组成的原因可能是16S rRNA基因测序的局限性。因此，宏基因组测序可以在确定的物种水平和功能分析方面改善AUC和数据解释。综上所述，这些结果为潜在的临床诊断价值提供了有益的证据，并为进一步鉴定抗NMDAR脑炎中确定的肠道微生物的“特征性模式”奠定了基础。
值得注意的是，抗NMDAR脑炎的肠道营养不良可能与不同的临床特征有关，例如癫痫发作，精神病和肿瘤。一些研究报告，这三个临床特征与胃肠菌群变化有关24，25。我们进一步研究了不同临床特征与肠道菌群之间的关联。有趣的是，非PCS组中的Veillonella属丰富，这表明它与精神疾病呈负相关。然而，它在抗NMDAR脑炎患者中也很丰富。先前的研究已经观察到Veillonella的水平显着增加自身免疫性肝炎和双相抑郁症25，26。需要提及一些可能的解释。一方面，Veillonella可以通过在特定条件下分泌某些代谢物质来预防精神疾病的发生。另一方面，一些非PCS受试者的样本可能会受到多种因素的干扰。然而，需要通过更大的样本和动物实验来验证不同临床特征之间的差异微生物组。
值得注意的是，我们发现相对于HCs微生物组，抗NMDAR脑炎患者的微生物组中果糖和甘露糖代谢过高，这可能与抗NMDAR脑炎的LPS血清水平升高和神经炎症有关患者27。同样，对小鼠的研究表明，即使中等剂量的葡萄糖和果糖也可以增强肿瘤发生28，这表明果糖代谢异常可能与抗NMDAR脑炎的肿瘤发展有关。此外，抗NMDAR脑炎的微生物组中LPS的生物合成途径也发生了变化，这与我们的发现相符，即抗NMDAR脑炎患者血清中LPS含量增加。除了果糖和甘露糖代谢和LPS生物合成途径明显增加外，抗NMDAR脑炎患者的基因组还通过色氨酸代谢改变来表征。色氨酸被肠道细菌降解为几种吲哚衍生物，吲哚充当芳烃受体（AhR）的配体，后者通过分泌IL-22促进上皮屏障功能29。这种改变可能在肠粘膜功能障碍中起关键作用。
我们还证明，与HC FMT小鼠相比，将抗NMDAR脑炎患者粪便中的微生物群转移至微生物群落枯竭的小鼠可诱导相关的行为表型。在小鼠模型中观察到的行为表型与多种人类精神疾病有关。值得注意的是，我们发现在这四种行为测试中，抗NMDAR脑炎FMT小鼠与HC FMT小鼠相比，并不像焦虑症一样活跃，但活动过度。先前的研究表明，肠道菌群可调节步行速度和运动方式30，这与我们的发现相符，即肠道菌群在抗NMDAR脑炎FMT小鼠中诱导机能亢进。此外，我们观察到学习和记忆任务的显着障碍，表明肠道微生物群落的破坏与认知能力有关。据报道，健康小鼠的微生物菌群移植来自高脂饮食31。已提出许多因素来介导肠道微生物变化与观察到的行为缺陷之间的关系。这些因素可以包括增加的肠通透性，炎症升高31，如在我们的研究中观察到，和降低的突触可塑性6，32。两者合计，这些结果表明，肠道菌群可能有助于抗NMDAR脑炎的超敏反应和认知障碍，尽管这些影响可能不是疾病特异性的。
肠道菌群可以通过多种方式调节免疫反应，例如影响抗原呈递和调节细胞因子的产生以及T淋巴细胞的功能33。我们进一步研究了FMT对T细胞反应的影响，该反应在抗NMDAR脑炎免疫损伤的调节和预后中起着重要作用34。抗NMDAR脑炎患者的脑脊液中也积累了Th17细胞，超过了对照组的34。。我们发现抗NMDAR脑炎FMT小鼠的SI LP和脾脏中的Th17应答增加，而Treg应答未受影响。上面提到的肠道菌群交替可能是造成这种效应的原因。这些结果表明在抗NMDAR脑炎中，肠道菌群对IL-17的潜在重要影响。亟需进一步研究以探讨B细胞与肠道微生物在抗NMDAR脑炎中的关系。
我们研究的主要优势包括在治疗开始之前收集新诊断的样品。然而，在这项研究中需要注意一些局限性。肠道菌群可能受到多个变量的影响。首先，寄主区域差异对肠道菌群组成有很大影响35。这些样本全部来自华南，因此可能会限制基于微生物群的诊断模型的应用。其次，参与者没有接受标准化饮食。肠道微生物群会受到许多饮食成分的影响，例如饮食脂肪，饮食蛋白质，饮食纤维。饮食模式包括生酮饮食，古石饮食，地中海饮食，纯素食/素食饮食，以微生物群为目标的饮食也可以调节微生物组成和代谢产物的产生。第三个限制是动物行为改变的机理解释。最后，我们没有单独的患者验证队列来测试探索队列的生物标记模型，因为样本量很小。
总之，这项研究表明抗NMDAR脑炎微生物组本身可以影响神经系统，Th17反应和行为功能。结果表明，免疫原性微生物和肠道粘膜通透性的增加以及抗炎代谢产物的减少是抗NMDAR脑炎发展和进程的驱动力。此外，在小鼠模型中，由抗NMDAR脑炎FMT引起的肠道菌群变化导致超敏反应，认知障碍和Th17细胞增多。我们的发现为通过MGB轴了解抗NMDAR脑炎的机制提供了新的框架，并可能导致新的治疗策略。
从2018年10月至2019年5月，共纳入中山大学第三附属医院神经内科的54名新诊断的抗NMDAR脑炎患者。排除了接受抗生素治疗或数据丢失的十四名患者。最后，纳入40例抗NMDAR脑炎患者（男18例，女22例；中位年龄22.00）和54例HCs进行进一步分析。（表1）抗NMDAR脑炎的诊断标准基于Graus等的诊断标准。36。根据生产商的说明，使用市售试剂盒（EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika，德国吕贝克），通过间接免疫染色，对来自患者的脑脊液（CSF）进行了针对NMDAR的IgG抗体测试。当患者在治疗前被认为是抗NMDAR脑炎患者时，我们首先收集了粪便样本，然后进行常规治疗。从门诊招募了总共54例年龄匹配的健康受试者（男性24例，女性30例，中位年龄23.00）（表1）作为对照组。所有的门诊病人（对照组）均来自中山大学附属第三医院体检中心。对照组必须满足以下纳入标准25：（1）肝肾功能检查的正常范围，（2）正常的空腹血糖，血脂，尿液和粪便，（3）在样品采集前1个月内未服用益生菌，益生元或抗生素。BPRS测量了精神病症状的严重程度，范围从18到126，并由两名资深精神科医生进行了评估。对照组的BMI，年龄和性别相匹配。该研究得到中山大学附属第三医院医学伦理委员会的批准（批准文号：[2018] 02-363-01）。患有严重认知障碍的患者的受试者或监护人提供了书面知情同意书，以进行研究和发表。
将血液血清保存在-80°C，直到进行D -Lac和DAO分析。根据制造商的说明，使用市售的酶联免疫吸附测定试剂盒（Cloud-Clone，武汉，中国）测试血清D-Lac和DAO浓度（肠道通透性损伤的标志）。
根据美国国家卫生研究院实验动物护理和使用指南并经华南农业大学生物伦理学委员会批准，按照动物护理指南，使用C57BL / 6J野生型（WT）雌性小鼠进行动物实验（批准ID：2019-D063）。C57BL / 6J WT雌性小鼠购自广东省医学检验动物中心（中国广州）。华南农业大学（中国广州）将所有小鼠维持在无特定病原体的条件下。抗CD4 FITC缀合，抗Foxp3 PE-Cy7缀合，抗IFNγPE-Cy7缀合和抗IL17A PE缀合的抗体购自（Thermo Fisher Scientific，美国）。
适应一周后，将6周大的雌性小鼠随机分为两个实验组之一：抗NMDAR脑炎FMT组和HC FMT组。分析了所有三个独立的重复FMT实验的每个笼子的平均值（每个笼子有3-4只小鼠/笼子，每个组有2个笼子），而不是单独的小鼠。如前所述37，对六周大的C57BL / 6雌性小鼠用抗生素混合物进行处理以消耗其肠道菌群，然后用作FMT的接受者。抗生素治疗由甲硝唑，万古霉素，新霉素和氨苄青霉素的混合物组成，在饮用水中给药1周（每1升水使用抗生素：1克甲硝唑，500毫克万古霉素，1克新霉素，1克氨苄西林）。另外，每隔一天通过口管饲喂200mL抗生素混合物，持续一周。对于移植，每天通过口服管饲法从抗NMDAR脑炎患者和HCs随机选择的亚组中收集粪便，持续一周，以定殖于受体小鼠。收集患者的新鲜粪便，并立即将其放置在标准无菌厌氧收集管中，并储存在-80°C下。然后将100 mg粪便重悬于1 ml无菌盐水中，并使用台式涡旋将溶液剧烈混合10 s，然后以800 g离心3分钟。收集上清液，并在10分钟内通过口腔管饲法（每只受体200μL）递送至受体小鼠，以防止细菌组成发生变化。最后，在FMT后2周对小鼠进行行为测试和流式细胞仪测试。
如前所述，在高架迷宫测试中评估了焦虑相关行为38。
如先前所述39，在露天测试中测量自主行为。
如前所述，在新颖的物体识别测试中对非空间学习和记忆进行了评估40，并稍加修改。
如先前的工作41所述，在莫里斯水迷宫中评估了空间学习和记忆，并做了一些改动。
收集粪便样品并如以前的工作的描述进行的16S rRNA测序33，42。将新鲜的粪便样品立即冷冻在-80°C进行后续分析。根据制造商的说明，使用QIAamp DNA Stool Mini Kit（德国Qiagen）从粪便样品中提取细菌DNA。我们使用聚合酶链反应（PCR）扩增了细菌16S核糖体RNA基因的高度保守的V4区。PCR产物用AmpureXP珠子（AGENCOURT）纯化，以去除非特异性产物。合格的文库在MiSeq系统上使用PE250（PE251 + 8 + 8 + 251）或PE300（PE301 + 8 + 8 + 301）（MiSeq试剂盒）进行配对末端测序。
从小鼠中取出脾脏和SI LP进行流式细胞术分析。对于细胞内细胞因子染色，脾脏和从指定的器官中分离的淋巴细胞进行刺激，固定和透化，如前所述42，43，随后荧光缀合的胞内细胞因子抗体染色。使用Foxp3染色缓冲液组（eBioscience，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）将核内Foxp3染色。通过CytoFLEX检测样品，并使用CytoExpert（Beckman Coulter）分析数据。
使用GraphPad Prism 6.0软件使用未配对的两尾学生t进行人口统计学和临床数据分析-检验，Mann-Whitney U检验或卡方检验，其统计显着性确定为0.05。使用R软件包（2.15.3版）和索引工具（如Chao 1，Simpson，Shannon，ACE，Observed Species和LEfSe）进行测序数据的统计分析。LEfSe分析用于鉴定患者和对照之间差异丰富的分类单元或途径。该方法使用非参数阶乘Kruskal-Wallis和秩检验来检测具有明显微分丰度的特征，然后使用LDA计算每个特征的效果大小。绘制了工作特性曲线（ROC），并计算了每条曲线的AUC，以评估使用sklearn软件包的模型的诊断性能。44。独立的粪便微生物群翻译动物实验至少重复两次。调整的 p值<0.05是根据微生物菌群数据和行为测试中的Benjamini-Hochberg程序进行的 45。
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