胚胎干细胞（ESC）具有特定的基因表达模式，赋予其无限增殖能力并实现多能性，这使ESC可以响应发育信号而分化为多种细胞类型。与分化的细胞相比，ESC具有更高水平的同源重组（HR）相关蛋白，并具有出色的细胞周期控制能力，其特征在于高增殖率和S期延长。HR参与染色体维持的多个方面。例如，HR修复受损的染色体并防止细胞增殖过程中DNA复制叉的崩溃。因此，HR对于维持基因组完整性是必不可少的，并且可以防止细胞失调和致死性事件。此外，延长的S期中丰富的HR蛋白可以有效地保护ESC免受外部损害，并防止DNA断裂引起的基因组不稳定，从而促进染色体复制后快速，准确的DNA断裂修复。维持基因组完整性是保持ESC功能并降低癌症发展，细胞周期停滞和异常复制的风险的关键。在这里，我们回顾了干细胞特异性HR过程与DNA损伤反应之间的基本联系，以及ESC用于维持基因组完整性的不同策略。维持基因组完整性是保持ESC功能并降低癌症发展，细胞周期停滞和异常复制的风险的关键。在这里，我们回顾了干细胞特异性HR过程与DNA损伤反应之间的基本联系，以及ESC用于维持基因组完整性的不同策略。维持基因组完整性是保持ESC功能并降低癌症发展，细胞周期停滞和异常复制的风险的关键。在这里，我们回顾了干细胞特异性HR过程与DNA损伤反应之间的基本联系，以及ESC用于维持基因组完整性的不同策略。
源自内部细胞团（ICM）的胚胎干细胞（ESC）具有自我更新和多能性的能力，而多能性是分化为多种细胞类型的能力。在早期胚胎发育中，需要精确修复产生的突变，以防止染色体缺陷，不育或死亡1。因此，ESC采用使DNA突变的积累最小化的特定过程来维持其基因组完整性。除了防止突变积累外，ESCs还具有修复DNA损伤和躲避子细胞2中突变繁殖的卓越能力。
重要的是要了解ESC的精确DNA修复系统，因为这种机制可以使ESC应对DNA损伤并帮助其保持基因组完整性3。在ESC中，DNA损伤的不断发生是通过严格控制的DNA损伤反应（DDR）系统解决的。细胞通过的DDR的立即采取行动，以损坏的反应，这导致细胞周期停滞和DNA修复基因的表达4，5。G1，S和G2 / M期检查点的细胞周期停滞允许DNA修复机制，例如错配修复（MMR），碱基切除修复（BER），核苷酸切除修复（NER），非同源末端连接（NHEJ） ）和同源重组（HR），以修复各种类型的DNA损伤6。在过度损伤的情况下，细胞激活程序性细胞死亡，这从增殖池7中去除了ESC 。但是，某些基本的DDR流程（例如G1和S阶段内检查点）在ESC中被绕过。此外，细胞周期蛋白和CDK1 / 2的高表达水平以及通过视网膜母细胞瘤（Rb）的过度磷酸化增加E2F1介导的S期基因转录，使ESC迅速进入S期，从而导致相当短的G1期8。短G1期有助于通过最小化分化刺激信号的诱导保留多能性，而延长S期允许胚胎干细胞以利用高频基于HR-无差错的DNA修复机制在S操作/ G2期9，10。
胚胎干细胞优先利用于其他的DNA修复途径HR由于缩短G1和延长的S期与体细胞的比较，因此修复双链断裂（DSB的）具有增加的保真度11，12，13，14，15（图1）。特别地，胚胎干细胞在整个细胞周期中表现出HR相关的蛋白的相对高的表达水平15，16（图1C）。升高的HR蛋白（包括RAD51和RAD52）是整个细胞增殖过程中HR机制的关键因素，它们会立即定位到DNA断裂位点并在S期迅速促进HR通路的活性。这是可能的HR过程足以ESC的细胞周期中有效地修复异常的DNA 15，17。此外，HR相关蛋白的表达升高可以通过修复由这些蛋白质以调节染色质结构的独特能力引起的全球DNA断裂导致稳定分化15，18，19。这些特定的细胞调节系统为ESC提供了基因组稳定性。在这篇综述中，我们总结了在ESC中特异起作用的DNA修复途径，并讨论了通过HR过程稳定多能状态和基因组完整性之间的关系。
a胚胎干细胞（ESC）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的细胞周期模式比较。显示了ESC（mESC和hESC）和MEF的一般细胞周期图。b mESC和MEF中细胞周期成分表达的差异。与MEF相比，mESC连续表达细胞周期蛋白A / E，但缺乏细胞周期蛋白D的表达。这使ESCs在整个细胞周期中都保留了视网膜母细胞瘤（Rb）过度磷酸化，从而导致相当短的G1期。c mES细胞和MEF之间HR相关蛋白的表达模式。在整个细胞周期中，HR蛋白在ESC中高表达，而在MEF中不高。
真核细胞周期可分为四个阶段：Gap 1期（G1期）是细胞周期的第一个发育期，其中细胞决定为DNA复制做准备还是进入静止期（G0期）；而细胞则决定进入DNA期。合成阶段（S期）是DNA合成的阶段。Gap 2期（G2期）发生在DNA复制之后和有丝分裂之前。和有丝分裂期（M期）涉及染色体分离和胞质分裂，其中产生两个子细胞20。每个细胞周期阶段均与特定的丝氨酸/苏氨酸特异性激酶相关，该激酶通过调节该阶段所需的底物来控制细胞周期的进程21。这些激酶的蛋白质，也被称为细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK），是自激活或由细胞周期蛋白，它们是细胞周期调控的关键部件活化22，23。在早期G1阶段，生长促进因子通过胞外信号（特别是有丝分裂信号）（例如通过促分裂原激活的蛋白激酶（MAPK））刺激细胞，导致细胞周期蛋白D家族（D1，D2和D3）上调），其激活CDK 4和6 24，25。在G1晚期，细胞周期蛋白d和CDK 4/6的表达水平开始降低，而cyclin E的家庭（E1和E2）核蛋白和CDK2的被cyclin E的激活24，26。细胞周期蛋白E-CDK2的激活导致Rb蛋白成分（Rb，p107和p130）的磷酸化和失活27。除了Rb的磷酸化之外，Cdh1的失活是后期促进复合物（APC / C）的底物之一，诱导了对细胞分裂8的不可逆转的承诺。通过在G1期后期激活细胞周期蛋白E-CDK2来抑制Cdh1，可以使APC / C的功能失活。这允许E2F1介导的S期基因转录，并诱导细胞进展和进入S期28。在S期，细胞周期蛋白E可能被降解，从而导致细胞周期蛋白A-CDK1 / 2复合物活化，从而促进S期进程。在G2 / M过渡过程中，细胞周期蛋白B（进入有丝分裂的关键调节因子）会立即与CDK1一起转移到细胞核中，并使参与有丝分裂纺锤体染色单体分离和胞质分裂的许多靶蛋白磷酸化。细胞周期蛋白B-CDK2复杂以下有丝分裂的降解是其次的G1阶段的开始29，30。
细胞不断经历内源性应激（即DNA复制过程中的氧化应激）和外源性应激（即暴露于电离辐射中），最终可能导致DNA损伤（图2a）。当发生DNA断裂时，DNA修复系统通过激酶介导的几种蛋白质的磷酸化激活，例如共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白（ATR）和共济失调毛细血管扩张（ATM）。这两个因素是由DNA断裂激活，而不管这一事实ATR具有DNA断裂的宽响应，包括DNA双链断裂和单链断裂（单链断裂），而ATM主要响应DNA双链断裂5，6，7。因此，ATM和ATR都在ESC中多种DNA损伤条件下都参与DNA修复的启动。
一个 DNA损伤。（1）单链断裂（SSB），（2）嘌呤/嘧啶（AP）位点，（3）脱氨基，（4）TT二聚体，（5）DNA错配对（碱基对碱基）和（6）双-链断裂（DSB）。b DNA修复过程。各种类型的DNA损伤均可通过碱基切除修复（BER），核苷酸切除修复（NER），错配修复（MMR），非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）进行修复。
为了维持基因组完整性，细胞可以通过使用精确的DNA修复途径来应对DNA损伤，该途径通常可分为五类：BER，NER，MMR，NHEJ和HR（图2b）。BER是由DNA糖基化酶引发的，DNA糖基化酶消除了受损的碱基，从而产生了一个嘌呤/嘧啶双（AP）位点。这个网站是由AP识别核酸内切酶（APE1），通过DNA聚合酶其引发切除修复β（POL β），DNA连接酶III（LIG III），和X射线修复交叉互补1（XRCC1）用于短补丁BER（图2）。在长距离切除修复中，APE1识别SSB，通常通过DNAPolδ/ε依赖性的BER相关蛋白募集来修复SSB 31。NER是一种主要的DNA修复途径，可消除由紫外线和环境诱变剂产生的大体积DNA损伤（图2）。损伤蛋白，即RPA，XPA和XPC-TFIIH复合物，以随机顺序结合在DNA损伤部位并形成复合物，识别这些损伤并开始修复。然后，将XPC替换为复合物中的XPG。由ERCC1和XPF组成的异二聚体（也称为ERCC4）被募集到DNA损伤位点，并且XPG和XPF从5´和3´末端去除了受损的链。最后，通过增殖细胞核抗原（PCNA）和复制因子C（RFC）的复制辅助因子，Polδ/ε填补了缺口32。MMR纠正了由Msh2和Msh6组成的MutSα异二聚体识别的小插入/缺失错配对和碱基错配（图2）。然后，MutSα募集由Mlh1和Pms2（或酵母Pms1）组成的MutLα异二聚体。随后，通过RFC与DNA结合的PCNA激活MutLα以特异性切开新生链。这之后是错误消除，该错误通常取决于核酸外切酶1（EXO1）。然后通过DNAPolδ/ε的DNA合成完成DNA修复，然后进行连接33。NHEJ是直接粘合断裂的DNA DSB末端的重要DNA修复途径（图2）。因此，NHEJ途径不需要同源序列，并且不限于细胞周期的特定阶段。NHEJ由Ku异二聚体引发，它由KU70和KU80亚基组成，可识别DSB并与DSB末端结合34。KU异二聚体直接将催化多肽（称为DNA-PKcs）募集到DNA末端，以生成活性DNA-PK复合物。复中DNA-PKcs和KU70的/ KU80允许阿蒂米斯与5'-核酸内切酶和加工因素，如波尔关联μ /λ，其提供nonligatable DNA末端用结扎一致通过DNA连接酶IV，XRCC4，并且非同源最终连接因子1（NHEJ1）（称为XLF）35。HR是存在于所有生命形式中的一种有效的DNA修复过程。它可以对各种类型的DNA损伤进行高保真修复，包括DNA DSB，DNA链间交联（ICL）和DNA缺口。HR主要发生在细胞周期的S / G2期，因为它依赖于同源模板来产生配对的DNA链（图2）。）。HR由断裂的DNA末端形成和由MRE11，RAD50和NBS1（也称为Nibrin）组成的MRN复合物从5´到3´末端切除而引发。DSB处的ssDNA的两条短链是由核酸外切酶或核酸内切酶（包括EXO1）和成视网膜细胞瘤结合蛋白8（RBBP8，也称为CTIP）生成的，以形成ssDNA突出端，并由RPA包被以避免DNA二级结构的形成。然后，RAD52用重组介体RAD51代替RPA。所得的RAD51-ssDNA细丝侵入姐妹染色单体以执行同源搜索，并且与修复相关的DNA合成被多个DSB修复网络终止，这些网络涉及双霍利迪结（dHJ）的产生，从而导致交叉/非交叉结果或依赖于合成的链退火36，37。
细胞周期不仅代表细胞生长的紧密组织的机制，而且代表细胞命运决定的调节。特别地，在胚胎发育中，通过在干细胞或祖细胞中的细胞周期进程来控制细胞存活和组织稳态。
据报道，胚胎干细胞具有与短G1期和延长的S期细胞的独特的循环特性3，20，24，38。例如，鼠胚胎干（mES）细胞，多能细胞系，在植入前的早期发育阶段从小鼠胚胎衍生而来，通常来自子宫，与分化细胞相比，其细胞周期较快39。通常，估计在mESC中进行细胞分裂的时间为12 h，比体细胞的分裂时间快12 h 24（表1）。mESCs具有短的G1期，其中仅持续3小时，和异步单元的相当大的比例，S期（〜65％）与G1期（〜15％）相比，发现40，41。如在mESCs中所观察到的，人类ESC（hESCs）的细胞周期进程迅速且显示出短暂的G1期。但是，hESCs中细胞周期的调控略有不同。hESC的S期细胞比例（〜50％）比mESCs少，但体细胞（〜20％）则比mESC（12-13 h）长，但显示时间更长（15–16 h），但体细胞则没有细胞（23-25 1H）14，42（图1A，表1）。这些结果表明，hESCs与植入后成胚细胞衍生的干细胞相似，该干细胞源自植入后胚胎的组织，可产生适当的胚胎43。因此，在早期发育中存在多种形式的多能细胞。
以前的研究表明，由于分化的细胞中APC / C的高表达水平及其对早期有丝分裂的抑制作用，与分化细胞相比，ESCs中细胞周期蛋白E，A和B的表达水平以及CDK1和CDK2的活性均升高。抑制剂1细胞周期进程期间10，44（图1B）。这些因素使ESC能够在细胞周期中使视网膜母细胞瘤保持高磷酸化，并导致相当短的G1期8（表1）。短G1期最小化分化刺激信号的诱导和有助于保持多能状态，这可能是胚胎发育有利9，10。ESC缺少G1检查站；因此，外源压力，如UV辐射损伤的细胞，没有在G1期检查点被捕，但进展到S期，其中DNA复制发生45，46。胚胎干细胞中的延长的S期是负责通过利用高频HR过程中，无差错的DSB修复机制在S / G2期起作用促进DNA断裂的准确修复14，46。ESC在整个细胞周期中均显示高水平的HR因子。值得注意的是，据报道RAD51，RAD52和RAD54是HR过程的关键蛋白，通过抑制复制叉的塌陷并在延长的S期修复DNA断裂，使ESC能够促进有效的复制叉进展。15，17（图 1C）。因此，通过利用DNA修复偶联基因组完整性策略，ESC特异的细胞周期调节使细胞能够有效耐受多种压力，例如内源性复制压力或暴露于外源性DNA破坏剂。
mESCs没有完成移动到S期由于相对短的G1期前的复制步骤5，15。这导致不连续的DNA复制过程，从而导致DSB，这是由ssDNA缺口的积累引起的。尽管存在这些缺点，但在复制方面，mESC可以有效克服复制压力。ssDNA缺口的修复取决于核心重组酶RAD51和与HR过程相关的关键因素。RAD51在mESCs的耗尽导致G2 / M期停滞和复制叉崩溃3，17。但是，RPA–ssDNA核丝的形成不受RAD51消耗的影响，这意味着当RAD51介导的DNA修复或缺口填充受损时，ssDNA缺口会累积。15。考虑到关键的HR因子及其在S期的重要功能，可以认为在复制过程中，mESC中大量表达的关键HR因子迅速定位于DNA断裂位点或暴露的ssDNA。HR因子与DNA链结合，以防止额外的DNA断裂切除，这将产生未修复的ssDNA缺口，并有助于立即进行HR调节的复制后修复。因此，这些特征强烈暗示，HR因子的组成型表达通过防止mESC中ssDNA缺口的积累而在抑制连续DNA断裂中起关键作用，而mESC的S期相对较长，因此在复制过程中完全依赖于基因组完整性。
道尔顿和Coverdell表明，相对于S期G1期花费的持续时间可以提高用的roscovitine，CDK抑制剂，其抑制进入S期，破坏了多能状态，并诱导分化胚胎干细胞治疗47，48。这意味着G1相的长度对于调节多能性至关重要。在S期花费相对较长的时间如何稳定多能状态？复制DNA的S期的基本活性在细胞生命周期中为表观遗传调控和维持基因组稳定性提供了独特的机会，这可能与稳定多能状态有关。几种可能性之一是直接调节DNA复制的蛋白质也可能稳定多能性。geminin蛋白是在S期调节DNA复制的关键因素。该蛋白在诱导DNA复制起点微小染色体维持（MCM）解旋酶的装载和抑制重新建立的复制起点的18，19。显示geminin表达不足的小鼠胚胎无法形成ICM并发育超过8细胞期19。除了抑制复制起点的重建外，geminin对于维持干细胞样能力的核心指标（即Oct4，Nanog和Sox2 49）的表达也很重要。HR介导的DNA修复系统的畸变也会影响多能状态的不稳定。由于胚胎干细胞经历该过程中，RAD51和其他HR相关蛋白的表达水平降低，因为是的焦点形成由HR蛋白在DNA断裂位点的频率15，17，50。相反，增加了53BP1与HR过程的抑制因子RIF1的共定位频率，这表明HR过程相关的HR相关蛋白募集和DSB修复受损51。HR缺陷导致停滞的复制叉的分辨率降低，并降低了新复制起点的形成速率，这可能导致未程序化的分化。最近的一项研究表明，HR相关蛋白的异位表达通过修复染色质结构的独特能力而诱导的全局DNA断裂的修复，导致稳定的分化，从而可以维持较高的开放性常染色体状态基因组并促进修理利于染色质构15，52。
RAD51和辅助因子在DSB末端与未损坏的同源模板之间的同源性搜索和DNA链交换中起关键作用（表2）。HR蛋白在HR通路的所有三个阶段起作用：突触前，突触和突触后（图3a））。在突触前阶段，RAD51与ssDNA结合，这是由DSB末端的核酸外切酶作用或复制错误产生的。RAD51在涂有RPA的ssDNA中形成突触前丝。RAD52和各种腋窝因子可稳定突触前细丝组件。这允许RAD51介导的链交换。然后，将细丝中的ssDNA延伸以稳定接头分子的二级结构。细丝的延伸对于精确的DNA链入侵和同源性搜索很重要。在突触过程中，RAD51可以在入侵的DNA链与同源DNA模板之间形成物理连接，从而导致异源双链DNA的产生。RAD51双链DNA（dsDNA）细丝是通过探测细丝内的供体和侵入的ssDNA链而产生的。最后，36，53。在减数分裂过程中，减数分裂特异性DNA链交换因子Dmc1以与RAD51 53相似的方式促进同源模板之间的关节分子（DNA链入侵产物）的形成。但是，尚不清楚DMC1及其辅助因子HOP2和MND1是否在ESC中表达。
一个同源重组（HR）介导的DSB修复途径。HR通路通常可分为三个阶段：突触前，突触和突触后。在突触前，核酸酶产生DSB末端的单链尾巴（步骤1）。在突触过程中，Rad51辅因子对DNA链的入侵导致D环的形成（步骤2）。至少三个不同的途径，双链断裂修复（DSBR），断裂诱导的复制（BIR）和合成依赖性链退火（SDSA），共享D环中间体。在DSBR中（步骤3a-5a和5b），DSB末端被接合，导致形成双霍利迪结（dHJ）。dHJ是用于分离为非交叉或交叉产物的底物。在SDSA中（步骤3b，4b和5c），前导链从D环上移开，并用单链尾部重新退火，形成非交叉产品。在BIR中（步骤3b，4c和5d），D环组装成一个完整的复制叉并复制染色体的整个远端臂。b mESCs中复制叉的电子显微镜图像（从Ahuja等人3修改）。箭头指示ssDNA缺口。D，子DNA链；P，亲本DNA链。插图中的比例尺为200 bp。
HR过程可分为三个不同的子途径：DSB修复（DSBR），断裂诱导复制（BIR）和依赖于合成的链退火（SDSA）。这些子途径共享早期步骤，通过在细丝上组装RAD51-ssDNA来处理3'突出尾巴的DSB。首先，在DSBR途径中，DSBR链通过独立的链入侵或通过链退火的第二端捕获而继续与DSB的第二端接合，从而导致dHJ的形成。dHJ是底物，可通过布隆综合症蛋白（BLM）和拓扑异构酶3A（TOP3A）分离为非交叉产物，或通过特定的核酸内切酶（如FANCM，GEN1和SLX1-SLX4）拆分为交换/非交叉产物的底物53（表2）。在有丝分裂DSBR中，许多DSB被SDSA途径54修复。在SDSA中，入侵链从D环上移开，并与互补链合成了DNA。d-环路消除明确要求的马达蛋白，例如RAD54和BLM解旋酶或解旋酶SRS2（酵母）53，55（表2）。在缝隙修复中，侵入的钢绞线以单链尾部重新退火，始终形成非交叉产物。
如果在相邻的重复序列之间生成了DSB，则可以通过单链退火（SSA）对其进行修复。在SSA过程中，DNA末端被拉伸形成ssDNA尾部，可以将它们退火在一起。SSA途径不需要HR蛋白，因为修复途径不需要同源搜索和链入侵，但它可能需要RAD52，它调节退火。
在BIR途径中，D环可组装成完整的复制叉并复制染色体的整个远端臂，从而导致杂合性丧失。当缺少DSB的一个DNA末端时，由于缺少另一端的DNA或缺乏端粒酶的细胞中端粒延长，这种现象会更频繁地被诱导。BIR通常依赖于重组酶RAD51 53，56。
HR是主要的无错误DNA修复途径之一。它不同于其他修复机制，例如MMR，BER，NER和NHEJ。在mESC中，HR相关因子的表达水平比体细胞中的表达水平高约6倍，从而提供了基因组稳定性15。丰富的HR因子会影响与HR机制相关的细胞周期，从而导致细胞克服不稳定的染色质/染色体结构。据报道，ESC中的基因组突变频率低于体细胞中的基因突变频率[ 57]。HR因子大量表达，无论在细胞周期的阶段15，58，59，60，61。原因之一是，尽管细胞分裂的时间比体细胞短，但ESC中的S期却比体细胞长。令人惊讶的是，ESC中的复制叉中积累了大量的ssDNA缺口和断裂（图3b）。当RAD51耗尽时，mESC被阻滞在G2 / M转变中，这导致ssDNA缺口和敏感的DNA损伤，这可能会大大增加细胞死亡。因此，需要HR途径来维持细胞周期进程以及对来自长的s期的长寿命ssDNA引起的DNA断裂的应激反应或mESCs中的DNA损伤（图4）。此外，HR蛋白的增强活性对于通过维持基因组稳定性对细胞的多能性和自我更新起重要作用（图。4）。在分化过程中，HR因子RAD51，RAD52和RAD54倾向于以时间依赖性的方式稳定降低，并且DNA损伤很容易诱发细胞死亡。而且，HR因子与细胞周期特别是S期密切相关。但是，在mESC分化过程中，HR相关因子的水平显着下降。mESC的分化可能会导致表观遗传改变，染色质重组和内源性DNA断裂，从而影响基因组稳定性。此外，HR因子如RAD51，RAD52和RAD54的异位表达可增强基因组完整性，从而促进多能细胞分化15。这意味着丰富的HR因子通过在染色质重塑过程中有效且快速地修复DNA损伤来促进细胞分化。
在ESC自我更新或分化过程中，大量的HR因子促进DNA损伤的修复和复制压力的恢复，从而保持基因组完整性。
mESC主要利用HR介导的修复系统来破坏DNA，而体细胞则更喜欢使用NHEJ。当诱导mESC分化时，他们将其首选过程从HR介导的途径切换到NHEJ 46。此开关NHEJ诱导HR相关的因素，例如RAD51，所涉及的HR-介导的过程的减少15，46。这导致DNA修复效率低下，这使mESC无法保护和介导复制叉，从而导致通过ssDNA缺口的积累而导致高频率的DNA断裂。值得注意的是，体细胞中积累的突变降低了重编程期间转化为诱导性多能干细胞（iPSC）的可能性，但是HR因子促进了主动重编程62，63。在这种背景下，可以假设HR通路的高频可用性有助于稳定的细胞分化和重编程。
ESC具有独特的功能，例如多能性，自我更新以及通过调节转录因子分化为多种细胞类型。有趣的是，ESCs表达的HR因子水平高于体细胞。尽管细胞周期进展迅速，但这仍支持基因组完整性的维持。此外，HR因子的高表达可通过快速有效地修复断裂来加速分化并降低DNA断裂的增加率。当将重编程因子与HR因子一起转染到分化的细胞中时，与单独转染重编程因子时所观察到的效率相比，iPSC生成的效率会提高。因此，HR因子不仅在分化为体细胞方面而且在重编程为iPSC方面都可能发挥重要作用。
|
|
