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DONSON和FANCM与不同的复制体相关联,这些复制体的特征在于复制时机和染色质结构域

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发表时间:2020-08-10 14:28作者:武汉新启迪生物Xinqidibio来源:www.qidibio.com

DONSON和FANCM与不同的复制体相关联,这些复制体的特征在于复制时机和染色质结构域

哺乳动物基因组的复制需要复制体克服开放(eu)和浓缩(异质)染色质传递过程中的许多障碍。通常,复制应激研究表征了挑战性和未挑战性复制叉的混合种群,这些种群在S期平均,并为“应激”复制体的单个物种建模。在这里,在含有潜在复制障碍的细胞中,我们发现了两个不同的病变近端复制体。一种与DONSON蛋白结合,在S期早期,在常染色质标记的区域更常见。另一个与FANCM DNA转移酶相互作用,在S期后期更为突出,并支持异染色质。这两种形式也可以在无压力的细胞中检测到。

介绍

真核复制体是由CMG解旋酶[MCM2-7(M),CDC45(C)和GINS(go,ichi,ni,san)蛋白质(G)]至少组成的多蛋白复合物,在前导环周围形成一个环链模板。其它组分包括POLα,ε,δ和聚合酶,MCM10,以及一些辅助因子1234567来自多个实验室数十年非凡工作的结果,对生化活性复制体最小成分的鉴定和表征,必然反映了在严格控制的条件下对脱蛋白模型DNA底物进行的研究。然而,在体内有数百个复制体相关蛋白89据推测,这反映了表征活细胞中基因组复制的多层复杂性。例如,染色体结构的三维分析显示了两个主要域。A隔室包含常染色质,常染色质可访问,具有转录活性,并带有特定的组蛋白修饰标记,例如H3K4me3。B舱,更浓缩,包含非活动基因,许多重复的元素,并与不同的组蛋白修饰,包括H3K9me3 10相关联除了结构上的区别外,基因组区域在S期也受到复制的时间控制。隔室A中的序列倾向于在S期早期复制,而B区中的序列在S期后期重复1112

复制体组成的其他影响因子是经常遇到的障碍,它们阻碍或阻止了CMG解旋酶或DNA合成的进程。这些包括替代的DNA结构,蛋白质:DNA加合物,外源或内源性反应物引入的DNA共价修饰,核苷酸前体池耗尽等。复制应激激活了包括MCM在内的数百种底物的ATR(ATM和Rad3相关)激酶。蛋白1314,并刺激的许多因素招募到复制叉停滞1516这些功能可通过多种途径来缓解障碍,重建断叉并重新开始复制。

我们已经开发出一种方法来研究链间交联(ICL)施加的复制压力。虽然这些一直被认为是绝对的块任何过程,需要DNA解旋1718,我们发现,复制可以在活细胞的基因组中启动(移动)过去的一个完整的ICL 19(也见参考文献20)。的ICL的横动依赖于ATR,并且,部分地基于FANCM的转位活动2122FANCM被募集到ICL最近的复制体,其特征是ATR使MCM2磷酸化。此外,与FANCM的结合伴随着重塑GINS复合物23丢失的复制体的重塑

ICL遍历对FANCM的部分依赖提出了一个问题:还有哪些其他因素可以支持此活动。最近,描述了DONSON蛋白如在microcephalic侏儒症综合征突变2425该必需蛋白没有可识别的结构特征,它与复制体结合并有助于对复制压力的反应。在这里描述的工作中,我们发现,就像FANCM一样,DONSON与也缺少GINS蛋白的ICL近端复制体复合。两种应激复制体的不同之处在于S期不同阶段和不同染色质区域的活性。在没有ICL的细胞中,DONSON和FANCM与在复制时间和染色质结构域上显示相同差异性偏向的序列相关。

结果

DONSON有助于ICL遍历

我们已经开发出一种方法来跟踪在抗原标记的ICL附近复制。用地高辛配基-三甲基补骨脂素和长波紫外线(Dig-TMP / UVA)处理细胞,并在铺展前依次用5-氯-2'-脱氧尿苷(CldU)和5-碘-2'-脱氧尿苷(IdU)脉冲DNA纤维。掺入的类似物和Dig标签的染色显示了与ICL发生分叉的结果(图   1a;补充图   1a,b)。复制重新开始过去的ICL(横动)的缺陷的FANCM细胞减少,如前所示19最近,DONSON蛋白显示出有助于在复制应激的细胞响应2425尽管DONSON似乎不是常规的DNA修复因子(对于暴露于顺铂的细胞的存活并不重要,补充图   1c),但通过siRNA敲低可以降低DONSON的表达(图   1b;补充图   1d)。或通过患者来源的细胞发生突变(补充图   1e)确实影响了复制/纤维测定的结果。这些细胞的导线频率降低,而双倍缺陷细胞的导线频率进一步下降,这表明DONSON和FANCM对于ICL导线没有上位性(图   1b)。

图1:DONSON和FANCM以不同的途径运作,以促进复制遍历。
图1

一个 HeLa细胞用针对DONSON或FANCM或两者siRNA处理。将它们暴露于Dig-TMP / UVA,然后与CldU,然后与IdU孵育。制备纤维并通过针对类似物的免疫荧光检测和Dig标签ICL的免疫量子检测(Q点655,红色)显示图案。显示了代表性的图案。b模式分布的定量。带有ICL的光纤遭遇:NT = 417;siDONSON = 432;siFANCM = 417; siDONSON + siFANCM = 385,来自三个独立的重复样本。数据是平均值±SD Ç来自暴露于UVA(-)或TMP / UVA(+)的表达GFP(图1、2)或GFP-DONSON(图3、4)的细胞的染色质蛋白的IP免疫印迹。表明了蛋白质的身份。定量两个样品中PSF1和CDC45的量。代表性印迹(n  = 3)。数据是ATR抑制对GFP-DONSON与pMCM2S108,MCM2和MCM5相互作用的影响的平均值±sd d PLA测试。核数:用UVA处理的细胞中GFP-DONSON和pMCM2之间的PLA = 58,TMP / UVA = 94,TMP / UVA + ATRi = 55;GFP-DONSON和MCM2之间的PLA在UVA = 95,TMP / UVA = 89,TMP / UVA + ATRi = 93; GFP-DONSON和MCM5之间的PLA在UVA中为88,TMP / UVA = 79,TMP / UVA + ATRi = 73; 来自三个生物学重复。数据是平均值±SEM ëPLA评估了ATR抑制对GFP-DONSON与CDC45和PSF1相互作用的影响。在UVA = 70,TMP / UVA = 71,TMP / UVA + ATRi = 73时GFP-DONSON和CDC45之间的PLA核得分; UVA = 71,TMP / UVA = 64,TMP / UVA + ATRi = 77时GFP-DONSON和PSF1之间的PLA核的得分; 来自三个生物学重复。数据是平均值±SEM ˚F上GFP-DONSON之间的PLA ATR抑制作用的影响地高辛标记的ICL。得分核:媒介物= 72,ATRi = 87,三个生物学重复。数据为平均值±sem。对于复制模式频率实验和Western blotting图像分析(ac),使用双面不配对t检验来计算P值用于PLA实验(df),使用双面Mann-Whitney秩和检验确定差异是否显着。NS:不显着:P  > 0.05。源数据作为源数据文件提供。

与复制和复制体的关系是通过内源性DONSON蛋白或带有GFP标签的DONSON与未经处理的细胞(无TMP / UVA)的MCM蛋白的共免疫沉淀表明的,与先前的报道一致24FANCM 23结合的复制体相反,DONSON还与CDC45和GINS蛋白复合,表明与复制体的解旋酶功能形式有关(补充图   1f邻近连接测定法(PLA)2627证实了这些相互作用(补充图   1克)。经过TMP / UVA处理后,与MCM蛋白和CDC45的结合得以保持,而与GINS蛋白PSF1的相互作用则减少了(图5)。 1c)。在处理过的细胞中,PLA报告了DONSON和MCM蛋白以及pMCM2S108的接近性,它们在S108处被ATR磷酸化(图   1d)。与IP一致,DONSON和PSF1之间的PLA在对照细胞中为阳性,而在TMP / UVA细胞中则降低(图   1e)。这些数据证明了在进行或未进行TMP / UVA处理的细胞中,DONSON与复制体的关系。此外,它们区分DONSON从FANCM,其中,如前所示,不是在复杂的GINS蛋白在任一条件23

抑制ATR阻止FANCM与复制体的结合23相反,DONSON和ICL之间的PLA在对照细胞中是阳性的,并且在ATR抑制后会增加(图   1f)。因此,对ATR抑制的反应也使DONSON:复制体与FANCM:复制体区分开。这些结果由DONSON遇到的情况解释:带有ICL的复制体伴随着GINS的丢失和ICL的遍历。在存在ATR抑制剂的情况下,那些复制体在ICL处积聚,导线被阻断,并且GINS被保留。

DONSON和FANCM位于不同的副本

为了确定FANCM和DONSON是否在相同的复制体上,我们进行了顺序免疫沉淀(IP)实验(图   2a)。染色质是由暴露于TMP / UVA的GFP-DONSON细胞制备的,经DNA消化,然后将蛋白复合物与抗PSF1的抗体一起孵育,而PSF1则是功能完整,不受压力的复制体的标记。沉淀物包含目标PSF1,MCM2,DONSON,但既不含FANCM也不含pMCM2S108(图   2b)。IP的第二个周期确认了这些复制体的清除(补充图   2a))。然后将上清液与针对GFP-DONSON的抗体一起温育。IP包含GFP-DONSON和pMCM2S108,但不包含FANCM,也没有包含PSF1。在针对GFP-DONSON的另一个IP处理之后,将剩余的上清液与针对FANCM的抗体一起孵育。该IP包含FANCM,pMCM2S108,但没有DONSON和PSF1。IP顺序的反转(DONSON之前的FANCM)没有改变结果(补充图   2b)。因此,有两个与DONSON相关的复制体:(1)复制体:与GINS相关的CMG-D,独立于TMP / UVA,没有被ATR磷酸化标记;(2)复制体:由TMP / UVA诱导的CM-D,带有pMCM2S108,而不是PSF1或FANCM。FANCM复合体,复制型:CM-F,具有pMCM2S108,但没有GINS或DONSON。在所有样品中都发现了CDC45和辅助蛋白MCM10,MCM8和RAD51(补充图   2c)。这些实验是在表达GFP-DONSON的HeLa细胞中进行的。为了测试这些结果的普遍性,我们在源自视网膜色素上皮细胞的hTERT永生化二倍体RPE1细胞系中重复了该实验,并用于细胞对遗传毒性应激的许多研究28他们显示出与HeLa和DONSON补充的患者来源细胞相同的ICL穿越频率(补充图   2d)。除了使用针对内源性DONSON蛋白的抗体以外,进行了连续IP。结果与使用GFP-DONSON HeLa细胞的结果相同(补充图   2e)。

图2:DONSON和FANCM位于不同的复制体上。
图2

对DONSON和FANCM相关的复制体连续的IP方案。表达GFP-DONSON的HeLa细胞仅暴露于UVA或TMP / UVA。制备了染色质,并用苯并酶消化。其次是针对PSF1的IP(去除无应力的复制体),然后针对GFP的上清液的IP(去除残留的DONSON相关蛋白),最后针对残留的上清液的IP捕获FANCM结合的蛋白。b连续IP的蛋白质印迹分析。代表性印迹(n  = 3)。C仅暴露于UVA或TMP / UVA的细胞中的PLA显示GFP-DONSON与MCM2之间存在相互作用。以及FANCM和MCM2;但不在GFP-DONSON和FANCM之间。核评分:GFP-D之间的PLA:MCM2,UVA处理= 174;TMP / UVA = 148;FANCM之间的PLA:MCM2,UVA = 142;TMP / UVA = 145;GFP-D之间的PLA:FANCM,UVA = 135;来自三个生物学重复的TMP / UVA = 133。数据为平均值±sem。使用了两边的Mann-Whitney秩和检验确定差异是否显着。NS:不显着:P  > 0.05。d复制体与带有Dig标签的ICL的关联。从暴露于UVA或Dig-TMP / UVA的细胞中制备染色质,然后通过超声将DNA还原为<500 bp的片段。进行顺序IP,并从每个级分中分离出DNA,点到硝酸纤维素上,并用针对Dig标签的抗体进行探测。LINE-1重复元素用作加载控件。代表性印迹(n  = 2)。e汇总顺序IP实验结果的模型。源数据作为源数据文件提供。

用GFP-DONSON HeLa细胞进行的PLA分析与IP实验一致。在UVA和TMP / UVA处理的细胞中,DONSON与MCM2的相互作用均为阳性(图   2c)。在用TMP / UVA处理的细胞中,FANCM和MCM2之间的PLA可检测到,但在没有ICL的细胞中较低,而在对照和TMP / UVA处理的细胞中,DONSON和FANCM之间的PLA则阴性。

然后,我们测试了复制子与ICL的关联。我们用Dig-TMP / UVA处理细胞,并按图2a的顺序对超声处理至小的DNA片段大小(顺序ChIP)的染色质进行顺序免疫沉淀   回收来自每个IP的DNA,并检查Dig标签的存在。PSF1样品中没有信号,但随后的两个沉淀均为阳性。因此,ICL与包含CM-DONSON和CM-FANCM但不包含CMG-DONSON的复制体相关(图   2d,e;补充图   2f)。

DONSON和FANCM复制体在S期早期和晚期

为了确定CM-DONSON和CM-FANCM复制体是否同时在同一细胞中,我们对在标记为促进对相同细胞进行重新分析的平板上生长的TMP / UVA处理的细胞进行了顺序PLA(图   3a ;补充图   3a)。拍摄了DONSON:pMCM2S108 PLA的图像,去除了板上的抗体,接着是FANCM:pMCM2S108 PLA。对第一次分析中检查的细胞进行重新成像,并将两个图像按xyz对齐(方法)。有些细胞的DONSON:pMCM2S108信号多于FANCM:pMCM2S108,而其他细胞则相反(图   3a))。此外,尽管一些细胞具有两种测定的信号,但它们并未共定位,表明这些复制体位于不同的基因组位置(补充电影   1)。

图3:DONSON和FANCM复制体在S期的不同阶段均活跃。
图3

暴露于TMP / UVA的GFP-DONSON表达细胞进行GFP-DONSON:pMCM2S108复合物然后FANCM:pMCM2S108的连续PLA分析。第一次PLA后,照相细胞(图像的第一列),剥离抗体和PLA产物(第二列)。进行第二次PLA,并对细胞重新成像(第三列)。第四列显示了使用DAPI信号xyz平面中配准图像后合并的两个图像示出了具有来自第一PLA和第二PLA的强信号,或者来自第一PLA的强信号但不来自第二PLA的强信号,或者来自第一PLA和第二PLA的强信号的单元的示例。来自两个PLA的信号不会共定位。b从分选的细胞中分离出早期和晚期S期级分。每个部分的PCNA染色模式。c GFP-D:分选的早期和晚期S期细胞中的pMCM2S108 PLA。得分核:GFP-D:来自三个生物学重复的早期S期= 62,晚期S期= 60的pMCM2S108。数据为分选的早期和晚期S期细胞的平均值±标准误差d FANCM:pMCM2S108 PLA。得分核:FANCM:早期S期= 63,晚期S期= 64的pMCM2S108,来自三个生物学重复。数据为平均值±sem ef DONSON和FANCM对早期和晚期S期细胞中ICL复制遇到的模式的影响。用针对DONSON或FANCM的siRNA处理细胞,使其暴露于Dig-TMP / UVA并用核苷类似物脉冲处理,如图1所示。 1a分选细胞,并分析早期和晚期S期的纤维形态。数据为平均值±标准偏差。对于PLA实验(cd),使用了双面Mann–Whitney秩和检验;对于复制模式实验(ef),使用了双面非配对t检验,以确定差异是否在统计学上显着。NS:不显着:P  > 0.05。源数据作为源数据文件提供。

为了理解这些结果的基础,我们用TMP / UVA处理了细胞,然后通过流式细胞术恢复了早期和晚期S期细胞(图   3b;补充图   3b)。带有Dig标签的ICL和pS108MCM2之间的PLA在两个细胞级分中均显示了与ICL近端应激复制体相同的频率(补充图   3c)。DONSON:pMCM2S108和FANCM:pMCM2S108每组进行了PLA。DONSON复合物在S期早期的频率是晚期的四倍,而FANCM复合物在S期晚期的频率比早期的频率高十倍(图   3c,d)。G 1中两个伙伴集的负PLA相细胞为试剂和测定的特异性提供了重要的内部控制(补充图   3d)。

早期和晚期S期组分之间的明显区别反映了早期S期细胞与晚期S期细胞的分离。另一方面,当我们检查中S期细胞时,两个应激复制体的PLA频率之间的明显差异消失了,这表明中应激S期细胞中都存在两个应激复制体(补充图   3e)。

在用siRNA / DONSON处理的细胞中测试了DONSON对S期早期和后期与ICL的复制叉相遇的影响。在S期早期的细胞中,单叉停滞事件增加,横越频率下降,而在S期晚期的细胞中,变化几乎没有(图   3e,f)。相反,在用siRNA / FANCM处理的细胞中,晚期S期细胞单叉停滞增加,且遍历频率降低,对早期S期模式的影响相对较小(图   3e,f)。因此,DONSON:应激复制体在S期早期对遍历模式的贡献大于后期,而FANCM:复制体在S期晚期更为重要。因此,取决于S阶段的阶段,一个或另一个的缺陷将不同地影响ICL重复遇到的结果。

Alu序列在S早期复制,Satellite 3序列在S晚期复制,而LINE-1元素在29整个复制用TMP / UVA处理细胞,并从顺序ChIP的每个馏分中分离DNA(如图2f所示   ),并检查这些重复序列的存在。如所期望的,由PSF1标记的复制体与所有序列相关。然而,Alu序列的恢复偏向于复制体:CM-DONSON部分,而卫星3的回收率更高于复制体:CM-FANCM(图   4a)。在所有馏分中均发现了在整个S期均复制的LINE-1。

图4:DONSON和FANCM与复制时间和染色质结构域的关系。
图4

用UVA或TMP / UVA处理细胞。一个连续IP演示的早期复制与DONSON与FANCM晚复制卫星3个序列的Alu序列关联。LINE-1元素在整个S相中复制,并存在于所有馏分中。代表性印迹(n  = 3)。b在S期早期细胞中,DONSON与H3K4me3常染色质标记的相互作用比在S期后期更为频繁,而在任一阶段中,与H3K9me3异染色质标记的相互作用都很少。通过PLA检查分选的早期和晚期S期细胞。得分核:来自三个生物学重复的GFP-D:早期S期的H3K4me3之间的PLA = 67,S期后期= 64,GFP-D:早期S期的H3K9me3之间的PLA = 70,S期后期= 85,来自三个生物学重复。数据是平均值±SEM ÇFANCM与H3K9me3异染色质标记的相互作用偏向S期后期,而在任一阶段与H3K4me3的相互作用频率均较低。得分核:来自三个生物学重复的FANCM:早期S期的H3K4me3之间的PLA = 64,S期后期= 66,FANCM:早期S期的H3K9me3之间的PLA = 67,S期后期= 77,来自三个生物学重复。数据为平均值±sem d。顺序IP证明DONSON与H3K4me3的关联比H3K9me3大,而FANCM与H3K9me3的关联大于H3K4me3。代表性印迹(n  = 3)。对于bc中的 PLA实验,使用双面Mann-Whitney秩和检验确定差异是否具有统计学意义。NS:不显着:P > 0.05。源数据作为源数据文件提供。

活跃的基因在S期早期复制,并发现在常染色质中,以组蛋白H3K4三甲基化为特征30,而失活的基因复制到晚期,并在异染色质中,以H3K9三甲基化为特征31我们用TMP / UVA处理细胞,并检查了GFP-DONSON与早期和晚期S期细胞中两个染色质标记的接近性。在S期早期,含H3K4me3的PLA信号频率比后期高4倍,而含H3K9me3的PLA在这两个阶段均弱得多(图   4b)。在早期和晚期S期细胞中FANCM和H3K4me3之间的PLA都非常低,而在晚期S期中H3K9me3的信号要强于早期S期细胞十倍(图   4c))。在RPE1细胞中重复了这些实验,结果相同(补充图   4a,b)。它们还通过在两个细胞系中的顺序染色质IP证实,表明H3K4me3与复制体:CM-DONSON复合物相关,而复制体:CM-FANCM与H3K9me3相关(图   4d ;补充图   4c)。这些实验的结果证实,在暴露于ICL施加的复制压力的细胞中,复制体的出现与FANCM或DONSON相关。

DONSON和FANCM复制体在未经处理的细胞中

先前的实验对包含ICL的细胞中的复制体进行了表征,并证明了DONSON复制体对S期早期的偏向。以前,DONSON被证明与细胞中的复制体结合,而没有暴露于DNA反应性化合物24,这是一个问题,即它是否与所有复制体或仅与一个复制体复合。为了解决这个问题,对未处理细胞的染色质蛋白进行连续IP处理,首先以DONSON为靶标,然后将上清液与抗PSF1抗体一起孵育以回收剩余的功能性复制体。回收了两种复合物:复制体:CMG-DONSON,随后复制体:CMG(图   5a))。这些结果确定了无应力细胞中复制体的两种形式:一种带有DONSON,另一种没有。然后,我们询问未处理细胞中的DONSON复制体在S期的不同阶段是否或多或少地丰富。GFP-DONSON和PSF1之间的PLA向早期S期显示约3.5倍的偏倚(图   5b)。FANCM与MCM2的接近性(尽管频率很低)(图   2c和   5c)在未处理的细胞中偏向S期晚期(图   5c)。通过免疫沉淀也观察到了FANCM与复制体蛋白的低频相互作用(图   5d)。

图5:在未处理的细胞中,DONSON和FANCM与复制体和染色质的相互作用。
图5

一个 DONSON同伙一些,但不是全部,在未处理的细胞复制体。从未经处理的GFP-DONSON-HeLa细胞制备染色质,并进行顺序IP处理,首先针对GFP-DONSON,然后针对残留上清液中的GINS蛋白PSF1。代表性印迹(n  = 3)。b GFP-DONSON和PSF1的PLA表明,在NT细胞中,DONSON相关复制体在S期早期比S期后期更为频繁。得分核:GFP-D之间的PLA:PSF1早期S期= 82,晚期S期= 81,来自三个生物学重复。数据是平均值±SEM ÇFANCM和MCM2之间的PLA在未经处理的细胞中,在S期晚期显示出低水平的FANCM相关复制体。得分核:FANCM之间的PLA:S期早期的MCM2 = 73,S期晚期= 75,来自三个生物学重复。数据为FANCM的平均值±sem d IP证实与复制体蛋白MCM2的低水平相互作用。Ë GFP-DONSON和H3K4me3的或的H3K9me3之间PLA。S早期的GFP-DONSON和H3K4me3的核分数= 79,S晚期的=78。S早期的GFP-DONSON和H3K9me3的核分数= 77,S晚期的核= 82,来自三个生物学重复。数据是平均值±SEM ˚FFANCM和H3K4me3或H3K9me3之间的PLA。在S期早期,FANCM和H3K4me3的核分数= 64,S期晚期=65。在S期早期,FANCM和H3K9me3的核分数= 68,S期晚期= 65,来自三个生物学重复。数据为平均值±sem对于bcef的 PLA实验,使用了双面Mann–Whitney秩和检验确定差异是否具有统计学意义。NS:不显着:P  > 0.05。源数据作为源数据文件提供。

我们还询问了DONSON和FANCM与未经处理的细胞中修饰的组蛋白的接近性。在GFP-DONSON或FANCM与H3K4me3或H3K9me3之间通过PLA进行细胞分类和检查。DONSON:H3K4me3信号分布在整个核中,在S期早期的频率是晚期的三倍,而在任一阶段,H3K9me3的信号很少(图   5e)。在两个阶段中,FANCM与H3K4me3之间的关联最小,而在S早期与H3K9me3的相互作用较弱,而S晚期则增强了约10倍(图   5f)。FANCM:H3K9me3 PLA信号主要定位在核外围,反映了H3K9me3染色质与核层的相关性32因此,DONSON和FANCM很大程度上驻留在不同的染色质域中,不需要ICL诱导的复制压力。用RPE1细胞获得了相似的结果(补充图   5a,b)。

DONSON和FANCM与基因组序列的关联

先前实验中未处理的细胞所表明的复制时间和基因组位置的偏差促使对没有ICL的细胞中的DONSON和FANCM相关DNA进行ChIP-seq分析(请参见“讨论”)。制备染色质,超声处理,并针对GFP-DONSON或FANCM进行免疫沉淀。分离DNA并进行下一代序列分析。将FANCM和GFP-DONSON [log2(ChIP / input)]在各个染色体上的富集与复制时间,Hi-C区室A和B的数据进行了比较。DONSON和FANCM相关序列在大多数区域的分布诸如1、5、9等染色体中的cDNA分别与复制时机和Hi-C A和B区室匹配良好(图   6a ;补充图   6a,c)。染色体(例如6、10和12)在DONSON和FANCM之间几乎没有重叠,但与早期和晚期复制的DNA以及A和B区室的相关性不那么强(补充图   6b,d,e) 。此外,还有DONSON和FANCM信号混合在一起的染色体(14、15)(补充图   6f,g)。与DONSON或FANCM相关的区域与任何染色体中的脆弱位点之间没有对应关系。相对于输入富集的DONSON和FANCM相关的DNA序列(横跨整个基因组)的小提琴图分别偏向于早期复制和在A区或后期复制和在B区中的序列(图   6b)。

图6:FANCM和GFP-DONSON的全基因组分布的ChIP-Seq分析。
图6

来自1号染色体代表性图谱,比较HeLa细胞中的RT(RT = log2(Early / Late)),由HeLa细胞的Hi-C数据计算出的特征向量定义的A / B区室以及FANCM和GFP-DONSON分布(在稳定表达GFP-DONSON的HeLa细胞中富集= log2(ChIP / input))。一些示例在与FANCM丰富的基因组区域对齐的后期复制区域中用红色阴影表示。一些早期复制区域以蓝色突出显示,与GFP-DONSON富集区域相对应。在RT配置文件中,正值和负值分别对应于早期和晚期复制。在特征向量轮廓中,它们对应于A和B隔室。轮廓上方的红色条形标记了包含易碎站点的区域。b小提琴图显示了富含FANCM或GFP-DONSON ChIP(log2 [ChIP / Input]> 0)以及A和B Hi-C区室(分别为> 0,<0的本征向量)的50 Kb基因组窗口的复制时间分布),然后将每一个与匹配数量的相同大小的随机选择的基因组窗口进行比较。小提琴图内的箱形图显示了中位数(中心线),上四分位数(Q3)和下四分位数(Q1)(框边界)以及不包括异常值的最高和最低值(极端线)。c在表达GFP-DONSON的HeLa细胞中,从晚期到早期复制区域,从晚期到早期复制区域,在25个复制时分位数内,对50 Kb基因组窗口中H3K9me3,H3K4me3,FANCM和GFP-DONSON进行了覆盖。d25个特征向量分位数内50kb基因组窗口的H3K9me3,H3K4me3,FANCM和GFP-DONSON的覆盖范围在表达GFP-DONSON的HeLa细胞中从B到A-Hi-C区室。cd的方框图中中心线表示中位数,方框边界表示上四分位数(Q3)和下四分位数(Q1),极端线表示不包括异常值的最大值和最小值,黑点表示意思。

为了评估整个基因组中的DONSON和FANCM与早期或晚期复制基因座之间的关系,我们计算了细胞中复制时分位数中各个ChIP-seq结果的覆盖率。作为原理证明,我们还使用已发布的数据(方法)来计算H3K9me3和H3K4me3组蛋白标记的覆盖率。如所预期的,允许的染色质标记H3K4me3逐渐向基因组的早期复制区域富集,而抑制性组蛋白标记H3K9me3逐渐向基因组的晚期复制区域富集。与H3K9me3相似,FANCM ChIP-seq数据越来越向后期复制区域扩展(图   6c)。DONSON ChIP-seq对与早期复制相关的分位数显示出偏见,尽管不如对晚期复制的FANCM连锁明显。另一个比较是Hi-C定义的A–B染色质区室的连续性。同样,FANCM捕获的序列明显偏向与沉默染色质和后期复制序列相关的B区室。DONSON结合序列的权重朝向A区室,但不如H3K4me3强(图   6d)。

讨论区

在活细胞中,越来越多的蛋白质与关联比复制体所需的最小生化重建933这些相互作用可以是组成型的或通过复制应激诱导的,但典型地解释为代表一个单一的复合物(见导言)1222343536373839404142另一种观点认为,本构性的或对压力的反应存在多种可区分的重复性变体,却受到的关注要少得多。我们的结果表明,在无压力的细胞中,两个组成不同的复制体在细胞中,另外两个在包含有效复制阻滞的细胞中。此外,我们发现复制复制时机和染色质位置也可以区分出不同的复制体。

在染色质区室A中,DONSON结合的复制体在具有常染色质组蛋白标记的基因组区域中组成性更普遍,并且与早期复制元件相关。FANCM在异染色质中位于B隔室中更为频繁,并且偏向于后期复制区域。支持这些结论的数据的清晰度取决于实验,在实验中分析了S期分离良好的细胞(PLA实验),或者将含有DONSON的染色质复合物与FANCM结合的染色质复合物分离(顺序IP)。但是,出于实际原因,ChIP-seq分析使用的是未分类的细胞,这些细胞必定包括S期各个阶段的细胞,从而模糊了早期和晚期之间的区别(参见补充图   3e)。)。尽管如此,在整个基因组上求和的ChIP-seq数据与早期和晚期复制细胞的实验结论一致。对单个染色体模式的检查显示,有些与DONSON / FANCM的早期/晚期偏差非常吻合,而与其他染色体的结果则不清楚。通常,与PLACM实验的结果一致,与FANCM结合的序列的区别比对DONSON的区别要强。应该注意的是,这些测量结果充其量只能反映DONSON和FANCM在基因组区域的位置,而不是转录因子所定义的特定位点。在整个基因组中起作用的DNA交易中涉及的因素,或在巨大的域(例如分配给A和B隔室的域)中,不太可能在整个细胞群体中同时出现在同一位置。在染色质折叠室与复制时间之间的关系分析中也注意到了这些考虑因素。1235

存在下,在活性染色质构DONSON复制体的,(复制体:CMG-d)表明复制应力的在对DNA损伤更敏感,并与转录ř碰撞环区域的蜂窝预期363738因此,在缺陷DONSON 2425将优先地影响在基因组中的活性基因区域,以复制应力的响应。DONSON是小头畸形综合症的突变体。通过转录活性基因区域的转运效率低下39可能会对S期的完成产生不利影响,从而对细胞数量产生不利影响,从而导致大脑和身体较小,这是具有DONSON突变的个体的特征。

另一方面,我们的结果表明,在非应激细胞中,FANCM与复制体的关联很少。未经处理的细胞中的FANCM:复制体可能是由于遇到具有内源性阻断的复制体所致。我们的数据表明FANCM偏向复制较晚的区域,并以与异染色质一致的组蛋白修饰为标志。因此,我们建议在这些域中遇到障碍的复制体位于具有关联的FANCM的环境中,并且是FANCM募集的目标。这些区域包含难以复制的序列31FANCM,一种古老的蛋白质,在古细菌中具有等价物21可能已经部分演变为对序列中的复制块做出反应,从而可能停止复制。在FANCM-症4041,我们将预期的是,在响应于复制应力的至少一个部件故障将在异42

在以前的工作中,我们表明ICL遍历的FANCM增量取决于转位酶的活性,而GINS的丢失仅需要蛋白质(包括转位酶无活性的蛋白)与复制体复合体的关联23因此,在遍历测定中蛋白质的功能可以分为至少两个步骤。我们建议复制重启路径是多步骤的,需要在复制体中打开一个门,以允许复制体移过ICL。这是否是MCM2和MCM5之间的栅极,这将被本GINS的损失被解锁43的替代栅极可独立打开本GINS状态,或4445个仍有待确定46此外,可能需要FANCM的转位酶活性,以使打开的复制体越过ICL或调节DNA结构越过屏障。这些不是排他性的可能性。

与FANCM相比,DONSON没有酶活性。因此,它可以作为促进S早期和中期遇到障碍的复制叉稳定性的因素的募集平台。例如,这些可能包括酶如SMARCAL1和ZRANB3从崩溃保护叉,并会提供一个转位活动,或许类似于FANCM 4748DONSON还被证明是有效激活ATR依赖性复制应激反应24所必需的最近的工作表明,它可具有比那些特定于活性复制体等功能4950

常染色质和异染色质域不是绝对的,而是主体在发展,肿瘤改变和老龄化315152确定这些变化对DONSON和FANCM相关复制体对复制压力的反应的影响将是令人感兴趣的。

方法

用料

Dig-TMP是通过将胺聚乙二醇与氯-TMP共轭合成的。然后使胺侧链与洋地黄毒苷的琥珀酸酯反应以产生洋地黄毒苷-TriMethyl Psoralen 53DONSON和FANCM的siRNA购自Dharmacon。L-017453-02-0005,ON-TARGETplus人DONSON siRNA SMART智能库(GAAAUCAUCUUUACGCGAU,UGGACAAAGUACUUGA UAU,GAGAUGGGUGUGCAAGAUA,ACUUAGUCAAAUACCGUUA)。L-021955-00-0005,ON-TARGETplus人FANCM siRNA-SMART库(GGGUA GAACUGGCCGUAAA,GAGAGGAACGUAUUUAUAA,AAACAGACAUCGCUGAAUU,GCAUGUAGCUAGG AAGUUU)。其他试剂是脂质转染胺RNAiMAX(Invitrogen,13778-150),Halt™蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Scientific,78446)和ATR抑制剂(VE821,Selleckchem,S8007)。

抗体

兔寡克隆抗-Dig,Invitrogen,目录号710019,200中稀释1;兔多克隆抗FANCM,Bethyl,目录号A302-637A,千分之1; 兔多抗组蛋白H3(三甲基K9),Abcam,目录号ab8898,500中的1;兔多抗组蛋白H3(三甲基K4)抗体,Abcam,目录号ab8580,500中的1; 兔抗MCM2抗体,Abcam,目录号ab4461,PLA为200的1,1000为1;兔抗MCM5抗体,Abcam,目录号ab17967,PLA为200的1,1000为1;兔抗MCM8蛋白,Proteintech,目录号16451-1-AP,千分之一; 兔抗MCM10蛋白,蛋白质,目录号12251-1-AP,千分之一; 兔抗磷酸MCM2S108,Abcam,目录号ab109271,200中的1; 兔抗PSF1,Abcam,目录号ab181112,PLA为200的1,1000为1; 兔抗RAD51,Abcam,目录号ab63801,千分之一; 小鼠抗FANCM,西格玛(Sigma),目录号SAB1407805,100分之一; 安德鲁·杰克逊实验室(Andrew Jackson Laboratory)的兔抗DONSON,500分之一;小鼠抗GFP,Abcam,猫#ab1218,500中的1; 兔单克隆抗体抗微管蛋白,Cell Signaling,Cat#9099,1 in 2000; 兔单克隆抗体抗GAPDH,细胞信号转导,目录号5174,千分之1;兔抗FANCM,Bethyl,Cat#302-637A,200分之一; 兔抗DONSON,西格玛(Sigma),货号HPA049033,200中的1; 小鼠抗H3K4me3 [304M3-B],绝对抗体,目录号Ab00699-1.26,500中的1;小鼠抗H3K9me3 [309M3-B],绝对抗体,目录号Ab00700-1.26,500中的1。Duolink®原位寡核苷酸PLA探针PLUS,Sigma-Aldrich,目录号DUO92002,每个反应8 µl;双链 小鼠抗H3K4me3 [304M3-B],绝对抗体,目录号Ab00699-1.26,500中的1;小鼠抗H3K9me3 [309M3-B],绝对抗体,目录号Ab00700-1.26,500中的1。Duolink®原位寡核苷酸PLA探针PLUS,Sigma-Aldrich,目录号DUO92002,每个反应8 µl;双链 小鼠抗H3K4me3 [304M3-B],绝对抗体,目录号Ab00699-1.26,500中的1;小鼠抗H3K9me3 [309M3-B],绝对抗体,目录号Ab00700-1.26,500中的1。Duolink®原位寡核苷酸PLA探针PLUS,Sigma-Aldrich,目录号DUO92002,每个反应8 µl;双链®原位寡核苷酸PLA探针MINUS,Sigma-Aldrich,目录号DUO92004,每个反应8 µl。

细胞,细胞培养,转染

将HeLa CCL-2和RPE1(ATCC)细胞保存在DMEM(Gibco)中,其中补充了10%的小牛血清(Gibco),100 U / mL青霉素和100μg/ mL硫酸链霉素(Gibco)。L-谷氨酰胺(Gibco),200μg/ ml潮霉素B(Invitrogen)和5μg/ ml Blasticidin(Gibco)培养表达GFP-DONSON的HeLa细胞24通过与1μg/ ml多西环素温育48 h,诱导被表达EGFP或EGFP-DONSON的pcDNA5 / FRT / TO-EGFP稳定转染的HeLa-Flp-In T-REx细胞。仅用pMSCV载体或pMSCV-DONSON稳定转导的DONSON 24突变患者9的细胞在补充有10%胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)L中生长-谷氨酰胺(Gibco),100 U / mL青霉素,100μg/ mL硫酸链霉素(Gibco)。常规测试所有细胞的支原体(Lonza,LT07-701)。为了确定DONSON和FANCM的敲低效应在DNA纤维测定中的作用,在第1天和第2天,使用RNAiMAX(Invitrogen)将10 nM siRNA(Dharmacon)转染HeLa细胞。实验在第4天,即72小时后进行。 siRNA转染。

染色质提取和免疫沉淀

总共将10 7个细胞悬浮在缓冲液A中(pH 7.9的10 mM HEPES,10 mM KCl,1.5 mM MgCl2、0.34 M蔗糖,10%甘油,1 mM DTT,10 mM NaF,1 mM原钒酸钠,0.1%将Triton X-100(带有蛋白酶和磷酸酶抑制剂)在冰上孵育5分钟。核通过离心在1300回收  4分钟。将核沉淀在缓冲液B(3 mM EDTA,0.2 mM EGTA,1 mM DTT,蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中在冰上溶解10分钟,然后在1700 g离心  4分钟。染色质重悬于苯甲酸酶缓冲液(Sigma,E8263,250 U / mL苯甲酸酶,pH 8.0的20 mM Tris-HCl,0.2 mM MgCl 2,2 mM NaCl,蛋白酶和磷酸酶抑制剂,并在4°C下孵育过夜。加入另外的250U / ml苯甲酸酶,并将样品再孵育3小时。通过离心澄清样品,并将上清液调节至200 mM NaCl,50 mM Tris-HCl pH 7.4、0.1%Tween-20。

为了进行免疫沉淀,将可溶性染色质样品在室温下用Dynabeads Protein G(Life Technologies)预清洗1 h,然后在4°C下与特异性抗体孵育过夜。对于连续的Co-IP,使用蛋白G磁珠(Pierce,10%v / v),GFP陷阱(Chromotek,gta-20)进行免疫沉淀。为了清除目标复合物,我们对每个免疫捕获进行了两次。用一种抗体完成捕获后,将上清液与另一种抗体孵育,依此类推。用PBST(磷酸盐缓冲液,0.05%Tween-20,pH 7.5)将所有的珠-抗体复合物洗涤3次,然后重悬于SDS-PAGE上样缓冲液中。在90°C加热10分钟后,根据标准程序通过蛋白质印迹分析蛋白质。

原位邻近结扎法(PLA)

细胞在Mattek玻璃底板上生长,然后仅用5 µM Dig-TMP / UVA,1.5 µM TMP / UVA或UVA处理。UVA暴露在Rayonet室中,为3 J / cm 2与新鲜培养基温育60分钟后,将细胞与0.1%甲醛温育5分钟,然后用CSK-R缓冲液(10 mM PIPES,pH 7.0、100 mM NaCl,300 mM蔗糖,3 mM MgCl 2处理)两次,0.5%Triton X-100、300 µg / ml RNAse),并在室温下于PBS(W / V)中的4%甲醛中固定10分钟,然后在-20°C的预冷甲醇中孵育20分钟。 。用PBS洗涤后,将细胞在37℃下用100ug / ml RNA酶处理30分钟。根据制造商的说明,使用Duolink PLA试剂盒(Sigma-Aldrich)进行原位PLA。简而言之,将细胞在37°C下封闭30分钟,并与相应的一抗(参见试剂清单)在37°C下孵育30分钟。用PBST(磷酸盐缓冲液,0.1%Tween)洗涤3次后,将抗小鼠PLUS和抗兔MINUS PLA探针与一抗偶联,并在37°C下孵育1 h。用缓冲液A(0.01 M Tris,0.15 M NaCl和0.05%Tween-20)洗涤3次5分钟后,将PLA探针在37°C下连接30分钟。用缓冲液A洗涤3次后,使用Duolink原位检测试剂(Sigma)在37°C进行100分钟扩增。扩增后,将细胞用洗涤缓冲液B(0.2 M Tris 0.1 M NaCl)洗涤3次,每次5分钟。最后,将它们涂上含有DAPI(Prolong Gold,Invitrogen)的封固剂。通过省略一种或另一种抗体来确认抗体特异性。在某些实验中,完成PLA程序后,通过用与Alexa 647偶联的PCNA抗体对细胞进行免疫染色来确定S期阶段。它们涂有含DAPI(Prolong Gold,Invitrogen)的封固剂。通过省略一种或另一种抗体来确认抗体特异性。在一些实验中,完成PLA程序后,通过用与Alexa 647偶联的PCNA抗体对细胞进行免疫染色来确定S期阶段。它们涂有含DAPI(Prolong Gold,Invitrogen)的封固剂。通过省略一种或另一种抗体来确认抗体特异性。在一些实验中,完成PLA程序后,通过用与Alexa 647偶联的PCNA抗体对细胞进行免疫染色来确定S期阶段。

PLA成像和定量

使用Plan Fluor×60 / 1.25数值孔径油镜在尼康TE2000旋转盘共聚焦显微镜上对PLA板成像。实验中的所有图像均以相同的曝光参数获取。量化是使用补充软件1提供的管道在CellProfiler上完成的。简单来说,管道执行以下步骤:使用DAPI通道识别核,过滤至最大大小的PLA焦点,使用核对象掩盖焦点图像(PLA焦点)以生成每个细胞计数的可视化表示,识别主要对象(PLA聚焦),在聚焦(“子代”)和细胞核(“父代”)之间建立父子关系,以确定子代的数量。每个核的焦点,并将结果作为每个核的PLA焦点数量导出到电子表格。P  > 0.5,显着:P  <0.001)。

顺序PLA和3D重建

在镀细胞之前,用金刚笔将Mattek玻璃底板在生长表面上标记,以便为单个显微镜视野的定位提供参考54GFP-DONSON:如上所述,用Duolink检测试剂绿色(Sigma,DUO92014)或橙色(DUO92007)进行pMCM2S108 PLA。获得了各个场的明场图像以及PLA的模式。然后将板与在5%蔗糖中的6 M胍:HCl在40°C下孵育10分钟,以剥离抗体和反应产物,然后用PBST洗涤。检查字段以确保完全清除信号,然后执行FANCM:pMCM2S108 PLA,检测寡核苷酸链接至Duolink检测试剂红色(Sigma,DUO92013)。找到第一个PLA后拍摄的细胞并再次成像。使用Volocity软件从第一和第二个PLA总共采集了16个覆盖面积为1.6μm的堆栈,并以OMETIFF格式导出。两组图像都被转换成。ims可以在IMARIS(位平面)上生成3D重建,如下所示。其中一组(PLA2)作为时间点导入到另一组(PLA1)中。接下来,在DAPI通道中创建每个原子核的表面,以便跟踪和校正两个PLA图像之间的平移和旋转漂移。然后将每个时间点保存为相应的PLA,最后将这四个通道合并为一张图像,以确认核的正确对齐(在DAPI通道上)并可视化两个PLA信号在同一细胞上的定位。合并图像的3D重建作为补充影片提供 在DAPI通道中创建了每个原子核的表面,以便跟踪和校正两个PLA图像之间的平移和旋转漂移。然后将每个时间点保存为相应的PLA,最后将这四个通道合并为一张图像,以确认核的正确对齐(在DAPI通道上)并可视化两个PLA信号在同一细胞上的定位。合并图像的3D重建作为补充影片提供 在DAPI通道中创建了每个原子核的表面,以便跟踪和校正两个PLA图像之间的平移和旋转漂移。然后将每个时间点保存为相应的PLA,最后将这四个通道合并为一张图像,以确认核的正确对齐(在DAPI通道上)并可视化两个PLA信号在同一细胞上的定位。合并图像的3D重建作为补充影片提供 1

DNA纤维分析

DNA纤维测定如下进行19:将细胞与6μMDig-TMP在37°C下孵育1 h,然后在Rayonet室中以3 J / cm 2的强度暴露于UVA光线中然后与10μMCldU孵育20分钟,然后与100μMIdU孵育20分钟。用胰蛋白酶消化细胞并将其悬浮在PBS中,然后将约200个细胞放在玻璃显微镜载玻片(Newcomer Glass)上,并加入10μl裂解缓冲液(在200 mM Tris-HCl pH 7.5中为0.5%SDS,50 mM EDTA)。将DNA纤维铺展并固定在3:1甲醇:乙酸中,用2.5 M HCl变性1 h,在0.4 M Tris-HCl pH 7.5中中和5 min,在PBS中洗涤,并使用抗Dig,抗BrdU一抗和相应的二抗。抗体和稀释液是大鼠抗BrdU(CldU),1:200;Dylight 647山羊防鼠,1:100;小鼠抗BrdU(IdU),1:40;以及Dylight 488山羊抗小鼠,1:100和Q-dot 655山羊抗小鼠1:2500。将载玻片固定在ProLong Gold防褪色固定介质中。使用Zeiss Axiovert 200 M显微镜和Axio Vision软件包(Zeiss)以×63放大倍率获取图像。量子点信号用Q点655滤波器成像。

早期和晚期S期细胞的分析

用1.5μMTMP / UVA处理表达GFP-DONSON的细胞,胰蛋白酶消化1小时后,将其悬浮在含有10%胎牛血清的DMEM中,并在室温下与16μMHoechst孵育30分钟。离心细胞,用分选缓冲液(HEPES pH 7.0、1 mM EDTA和5%胎牛血清)洗涤,然后悬浮于1 ml补充有1 mM N-乙酰半胱氨酸的分选缓冲液中。然后通过流式细胞仪解析细胞,并收集早期和晚期S期级分。门控如下:(1)前向(FSC)和侧向散射(SSC)排除碎片,(2)FSC-A和FSC-H用于双重识别,(3)用Hoechst 33342染色的细胞,被紫外线355激发根据DNA含量,将进入405nm处的纳米门进行门控,进入跨G1期和S期早期的门[R3]和门[R4],包括跨越S期晚期和G2的细胞。图2的源数据中提供的选通示例图。 3b

通过离心(Cytospin),将来自每个级分的细胞附着到载玻片上,用0.1%甲醛和PLA固定,在进行GFP-DONSON:pMCM2S108或FANCM:pMCM2S108之间进行。根据其特征性PCNA染色模式将细胞鉴定为S期早期或晚期。

染色质免疫沉淀(ChIP)用于DNA分析

细胞在培养基中用1%甲醛交联8分钟,然后用0.1 M甘氨酸淬灭甲醛。用PBS洗涤细胞,刮取,然后悬浮在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(0.5%SDS,10mM EDTA,50mM Tris-HCL pH 8.0)中。裂解液在4πC水浴超声仪(Bioruptor,Diagenode)中进行超声处理。调整超声处理的时间,以产生小于500 bp的短DNA片段(总共8分钟,进行30-s超声处理,然后冷却30 s)。在某些实验中,调整了时间以产生更长的500-5000 bp DNA片段(2×30 s,冷却时间为30 s)。如所示,将稀释的裂解物与抗体在4℃下孵育过夜。使用Protein G磁珠(Pierce,10%v / v)或GFP Trap(Chromotek,gta-20)进行免疫沉淀。用低盐免疫复合物缓冲液(0.1%SDS,1%Triton x-100、2 mM EDTA,20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl)洗涤结合了珠的复合物(0.1%SDS,1%Triton x-100、2 mM EDTA,20 mM Tris-HCl pH 8.0、500 mM NaCl),LiCl免疫复合物缓冲液(0.25 M LiCl,1%NP-40、1%mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 8.0)和TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA pH 8.0)。将DNA用蛋白酶K(100 µg / ml)在洗脱缓冲液(1%SDS,0.2 M NaCl)中于65°C过夜洗脱。根据制造商的说明,使用DNA Clean&Concentrator PCR纯化试剂盒(ZYMO Research,D4033)纯化洗脱的DNA。20 mM Tris-HCl pH 8.0、500 mM NaCl),LiCl免疫复合缓冲液(0.25 M LiCl,1%NP-40、1%mM EDTA,10 mM Tris-HCl pH 8.0)和TE缓冲液(10 mM Tris -HCl,1mM EDTA pH 8.0)。将DNA用蛋白酶K(100 µg / ml)在洗脱缓冲液(1%SDS,0.2 M NaCl)中于65°C过夜洗脱。根据制造商的说明,使用DNA Clean&Concentrator PCR纯化试剂盒(ZYMO Research,D4033)纯化洗脱的DNA。20 mM Tris-HCl pH 8.0、500 mM NaCl),LiCl免疫复合缓冲液(0.25 M LiCl,1%NP-40、1%mM EDTA,10 mM Tris-HCl pH 8.0)和TE缓冲液(10 mM Tris -HCl,1mM EDTA pH 8.0)。将DNA用蛋白酶K(100 µg / ml)在洗脱缓冲液(1%SDS,0.2 M NaCl)中于65°C过夜洗脱。根据制造商的说明,使用DNA Clean&Concentrator PCR纯化试剂盒(ZYMO Research,D4033)纯化洗脱的DNA。

点印迹分析

使用0.5 M NaOH和1.5 M NaCl使DNA变性,并使用Bio-Dot仪器(Bio-Rad)将等量的DNA上样到Hybond N +硝酸纤维素膜(GE Biosciences)上。将膜用变性缓冲液和洗涤缓冲液(3x SSC)洗涤一次,然后进行UV交联(UV Stratalinker 1800,Stratagene),并在37°C下用5x Denhardt溶液(Thermo Scientific)封闭1 h。与Alu-生物素(5'生物素-GGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAAAACCCCAGCA),Satellite III(5'生物素-TCCACTCGGGTTGATT)或LINE-1(5'生物素-GACTTCAAACTATACTACAAGGCTACA GTAACC)探针杂交过夜。使用化学发光核酸检测模块套件(Thermo Scientific,89880)进行信号检测,并使用带有Image Lab软件(Bio-Rad)的ChemiDox XRS采集图像。

蛋白质印迹

有关抗体的完整列表,请参阅报告摘要。在NuPAGE样品缓冲液(Invitrogen)中制备样品。然后在4-12%Bis-Tris蛋白凝胶中通过电泳分离蛋白质,并转移到聚偏二氟乙烯膜(Thermo Scientific)上。将膜在PBS中的0.1%Tween-20中的5%干奶中封闭,并用所示抗体检测。与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(BIO-RAD)孵育后,使用ECL检测试剂(GE Healthcare)可视化蛋白质。Source Data文件中提供了未经裁剪的Western blot凝胶图像。

统计和可重复性

使用Mann-Whitney秩和检验分析了PLA实验的统计学意义。使用双面不成对t检验分析纤维类型和免疫印迹,并在每种情况下给出确切的P值对于这两个测试:显着:P  <0.001,NS(不显着):P  > 0.05。所有实验至少进行了两次,每个图例中报告了生物学重复数(n)。

芯片序列

如上所述进行超声染色质的免疫沉淀。

DNA测序

对于DNA测序,将具有T型突出端的Illumina测序接头与沉淀的ChIP DNA片段或具有相应的A型突出端的输入DNA连接,以根据制造商的规程构建测序文库(Illumina,圣地亚哥,加利福尼亚) 。使用磁珠方案纯化片段,并进行18个循环的PCR扩增以在两端均带有衔接子富集片段。使用带有SPRIselect Beads(Beckman Coulter,Brea,CA)的双珠选择方案,通过大小选择(〜200–600碱基)再次纯化产物。这些文库在Illumina Hi-Seq 2500测序仪上进行测序,使用板载簇在快速运行的配对末端流动池上进行75×75个循环(DONSON),在75 bp的单末端进行75个循环(FANCM)。使用RTA v1.18.66进行实时分析。

ChIP-seq,RT和Hi-C数据

使用对应的RPKM归一化BigWig文件的Deeptools BigWigCompare计算FANCM或GFP_DONSON ChIP-seq与输入之间的log2比。来自HeLa单元的H3K9me3和H3K4me3 ChIP-seq数据分别从GEO下载:GSM2514495和GSM3398459。HeLa S3细胞的复制计时数据是从复制域数据库下载的,该数据库由吉尔伯特实验室(https://www2.replicationdomain.com/#:RT_HeLaS3_CervicalCarcinoma_Int 2355 8071_hg38)策划HeLa细胞的Hi-C数据是从NCBI下载的dbGaP phs000640.v8.p1(https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.11.021)。使用Juicer(-p KR,BP 50,000),以粗糙分辨率在Hi-C数据中描绘隔室的特征向量被计算为Pearson矩阵的第一主要成分。UCSC提升被用于将hg19转换为hg38基因组坐标。脆弱站点映射坐标是从HumCFS下载的:人类染色体脆弱站点数据库(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/humcfs/download.html)。

富含FANCM和GFP-DONSON的基因组窗口的RT分数

将基因组划分为50 Kb窗口,并计算每个窗口的平均RT得分。选择富含FANCM和GFP-DONSON的基因组区域作为每个ChIP中具有[log2(ChIP / Input)> 0]的50 Kb窗口。确定其相应的RT分数,并将其RT分数分布映射为小提琴图。小提琴内部的方框图表示中位数和四分位间距。随机选择的基因组区域(与每个样品匹配的基因组窗口的数量和大小)用作对照。所有随机样本均具有等效分布。在本征向量的情况下,我们使用50 kb的基因组区域,其中A区域的值> 0,B区域的值<0。不出所料,RT分数的分布严重偏向于A隔间的早期复制,

RT分位数的ChIP-seq覆盖

将基因组分成50 Kb窗口,并计算每个窗口的平均RT得分。计算每个基因组窗口每个ChIP BAM文件的覆盖率,并将计数转换为TPM(每百万个标签)。计算了RT分位数(n  = 25)。ChIP-seq覆盖率显示了从晚到早订购的25个RT分位数中每一个的TPM。

Hi-C特征向量分位数的ChIP-seq覆盖范围

使用Juicer(-p KR,BP 50,000),以粗糙分辨率在Hi-C数据中描绘隔室的特征向量被计算为Pearson矩阵的第一主要成分。特征向量分位数的ChIP-seq覆盖度计算如下:将基因组划分为50-Kb窗口,并计算每个窗口的平均特征向量得分。然后,我们为每个基因组窗口计算每个ChIP-seq BAM文件的覆盖率,将计数转换为TPM(每百万个标签),并计算Hi-C隔室特征向量分位数(n  = 25)。在TPM中显示了从B到A排序的25个特征向量分位数中的每一个的ChIP-seq覆盖率。

资料汇报

没有使用统计方法确定样本量。实验不是随机的,研究人员在实验和数据分析过程中也不会盲目。

数据采集

Zeiss的Axiovisionx64 4.9.1.0,用于获取光纤图像。

Volocity 6.5.1,Quorum Technologies,用于共聚焦显微镜图像采集。

Summit V5.5.0.16880软件,用于流式细胞仪数据。

Imaris×64,9.3.1,位平面,用于校正顺序PLA图像和3D重建上的平移和旋转漂移。

CellProfiler 3.1.8,开源,用于PLA定量。

数据分析

Axiovisionx64 4.9.1.0,Zeiss,纤维图像分析。

CellProfiler 3.1.8,开源,用于PLA定量。

Summit V5.5.0.16880软件,用于流式细胞仪分析。

Image Lab 5.1,凝胶密度分析。

GraphPad Prism 7,数值和统计分析。

用于ChIP-seq数据质量控制的Fastqc(0.11.9)。

BWA v.0.7.17,ChIP-seq分析。

SAMtools v.1.9,ChIP-seq分析。

Picard v.2.9.2,ChIP-seq分析。

BEDtools v.2.27.1,ChIP-seq分析。

DeepTools v.3.0.1,ChIP序列分析。

Juicer v.1.5.6,来自Hi-C数据的特征向量。

R v.3.5.2,ChIP-seq分析,RT分位数分析和图表。

UCSC工具箱v.388,ChIP-seq分析。

适用于Microsoft 365 MSO的Microsoft Excel。

CorelDraw X6,最终图形装配。

报告摘要

与本文链接的《自然研究报告摘要》中提供了有关研究设计的更多信息  

资料可用性

这项研究中生成的所有ChIP-seq和特征向量数据集都以登录号GSE150550存放在NCBI基因表达综合(GEO)数据库中来自HeLa细胞的H3K9me3和H3K4me3 ChIP-seq数据分别从GEO数据库GSM2514495GSM3398459下载HeLa S3细胞的复制定时数据是从Gilbert实验室(https://www2.replicationdomain.com/#:RT_HeLaS3_CervicalCarcinoma_Int 2355 8071_hg38)策划的Replication Domain数据库中下载的HeLa细胞的Hi-C数据从NCBI dbGaP phs000640.v8.p1下载从HumCFS下载了易碎位点映射坐标:人染色体易碎位点数据库(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/humcfs/download.html)图1和2的基础源数据。 1 b–f,2 b–c,3 b–f,4a–d,5a–d和补充图。 提供1c –g,2a –f,3c –e,4a –c和5a,b作为源数据文件。应合理要求,作者可提供所有数据。




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