在不同的神经系统疾病中经常检测到针对鞘糖脂上几种自身聚糖的抗体。它们的致病作用已被大量记载，但其起源的关键仍然难以捉摸。此外，在对细菌的免疫反应过程中，正常人血清中会出现识别非自身聚糖的抗体。使用HPTLC免疫染色，我们旨在表征针对携带自身聚糖（GM1 / GM2 / GM3 / GD1a / GD1b / GD3 / GT1b / GQ1b）和非自身聚糖（Forssman / GA1 /“ A”血）的糖鞘脂的IgM和IgG亚类抗体反应27位随机选择的神经系统疾病患者血清中对这些抗原中的任何一种具有IgG反应性。IgG2（p = 0.0001）和IgG1（p 抗非自身聚糖的IgG抗体的使用频率更高（= 0.0078），而抗体反应的受限制较少（两种或多种同时存在的IgG亚类）。相反，针对自身聚糖的IgG亚类分布对IgG3的存在表现出明显的优势（p = 0.0017）和受限制的IgG亚类分布（即单个IgG亚类，p = 0.0133）。有趣的是，同时存在IgM的抗自身聚糖IgG抗体的IgG2比例更高（p = 0.0295）。IgG亚类频率偏向 于“抗自身聚糖A”亚组（GM2 / GM1 / GD1b）的IgG1（p = 0.0266）和IgG3（p =“ 0.0007”）为“抗自身聚糖B”亚组（GM3 / GD1a / GD3 / GT1b / GQ1b）。讨论了在针对携带非自身聚糖和自身聚糖的糖鞘脂的体液免疫应答中支持同种型（MG）和IgG亚类模式差异的球员和/或抗原呈递途径的变化。
人血清通常显示抗聚糖抗体（即抗体的一个或多个类型的糖共轭物的识别序列糖类，不论诱导免疫原的）1。某些膜脂（称为糖鞘脂）表现出寡糖作为其亲水性头基，使病毒，毒素和抗体2可以结合。正常受试者通常会显示识别非自身糖鞘脂的天然存在的抗体：典型的例子是ABO血型凝集素，这是由血型“ 0”的人开发出能够凝集血型“ A” /“ B”的红细胞产生的抗体3。这些抗体出现在针对定植于肠道或呼吸道的细菌的正常免疫反应中4。我们的实验室描述了类似的IgM抗体的起源，它识别了一些神经糖苷类GM1和GD1b 5等自身糖鞘脂; 但是，这些低亲和力，交叉反应性IgM是非致病性的（正常的抗GM1 IgM抗体 6）。相反，自身免疫性疾病通常表现出对自身糖鞘脂 7的免疫反应性。特别是神经节苷脂（在神经系统中大量发现的糖鞘脂）经常被多种神经系统疾病中的抗体所靶向 8。抗神经节苷脂抗体引起的神经系统功能障碍的多种触发机制已得到充分证明：通过神经细胞膜上的补体活化在运动神经末梢形成膜攻击复合物（MAC），损害Ranvier结的轴突膜特性导致电压门控钠通道（Nav）和传导阻滞失灵；诱导背根神经节细胞凋亡级联激活；通过对电压门控的钙通道电流的突触前抑制作用，阻止运动神经末梢的神经递质释放；脂筏上某些受体作为信号传递平台的补体非依赖性功能改变；依此类推9。明显地，抗神经节苷脂抗体的起源还不清楚。从特定脂多糖之间分子模拟空肠弯曲杆菌血清型和神经节苷脂结构既可以原因格林-巴利综合征（通过诱导抗GM1和抗神经节苷脂GD1a的抗体）或米勒-费希尔综合征（通过诱导抗GQ1b抗体）10，11，12。有趣的是，只有一小部分人在感染了适当的C后会进一步发展为神经病。空肠弯曲杆菌血清型，暗示额外细菌或宿主约束13，14。对于抗GM1抗体，我们提出了这一额外要求，即随机引发影响正常抗GM1 IgM抗体结合位点的突变（“结合位点漂移”假设）15。总之，“分子拟态”和“结合位点漂移”假说相互补充，以描绘神经病相关的IgM和IgG抗GM1抗体是如何起源的16。
尽管有关IgM和IgG同种型的最新研究已将此观点扩展为解释与神经系统疾病有关的其他抗自身糖鞘脂抗体的起源17，但仍有一些问题。这些类型的IgG抗体的缺席在健康人6，17。多糖，其他一些非蛋白质抗原（例如鞘糖脂）和少量蛋白质（例如鞭毛蛋白）被视为非T细胞抗原（TI）：即它们能够激活B-1b和脾边缘区（MZ）B细胞而无需细胞内CD4 + T辅助细胞（Th）进行处理且缺乏帮助18。暴露于细胞因子（例如B细胞活化因子（BAFF）和增殖诱导配体（APRIL））（主要由树突细胞产生）的B-1b或脾MZ B细胞可以经历抗体类别转换19。相反，大多数蛋白质被抗原呈递细胞（B-2细胞，巨噬细胞和树突状细胞）内在化，被消化成肽片段，并与MHC类分子结合形成MHC肽复合物，该复合物显示在细胞表面。抗原呈递细胞可被Th细胞受体（TCR）识别。特异性识别激活B-2细胞（连锁识别），诱导抗体产生和类别转换。人类IgG同种型反应又分为四个亚类（1至4），它们具有不同的重链，这些重链会影响其自身的特性（例如Fc受体亲和力）和生物学功能（例如补体系统激活能力）20。自身免疫性疾病患者的总IgG亚类水平与健康个体中的水平没有实质性差异。然而，某些特定的抗体可以表现出可变的子类限制21，22，23。一般来说，IgG1和IgG3亚类主要针对蛋白质抗原，而某些聚糖抗原则优先诱导IgG2反应24。虽然抗原的性质可以影响引发的IgG亚类的类型25，但是IgG亚类也可以取决于T辅助细胞（Th）反应的类型26。Th1细胞产生干扰素-γ（IFN-γ）和白介素（IL）2，Th2细胞产生IL-4和IL-5 27和Th17细胞产生IL-17，IL-21和IL-22 28。尽管如此，Th1细胞之间的区别，-2和-17细胞较少在人类中明显比在实验小鼠模型29。上神经病相关的抗GM1之前的研究，抗神经节苷脂GD1a和抗GQ1b IgG抗体指示的IgG1，IgG3或两者优势30，31，32，33; 然而，这些研究缺乏针对非自身聚糖的亚类分布的同时评估以进行比较。在目前的工作中，我们评估了患有多种神经系统疾病的患者对各种自身和非自身携带糖基糖鞘脂的IgG亚类体液免疫反应。在这些抗体的潜在来源多样性的背景下，对反应性模式差异进行了全面分析。
我们通过HPTLC-I比较分析了27个随机选择的患者血清样本（对多种抗自身聚糖IgG抗体呈阳性）中抗非自身聚糖和抗自身聚糖IgG亚类抗体的百分比分布。图 1A以11号患者血清分析为例：抗非自身聚糖反应性包括抗福斯曼抗体（IgM），抗“ A”鞘糖脂抗体（IgM），抗Nt7抗体（IgM，IgG1和IgG2 ）和抗GA1抗体（IgM）。抗自身聚糖反应性是由抗GM2（IgM），抗GM1（IgM和IgG1）和抗GD1b（IgM和IgG1）抗体形成的。对所有评估的患者血清样品重复进行这些分析（参见补充图S1）。图 1B总结了针对每个神经系统疾病患者的抗自身和抗非自身聚糖IgG亚类抗体的不同分布。必要时，进行使用可溶性自糖基携带的糖鞘脂的抑制实验，以确认或丢弃IgM和IgG精细特异性的差异（结果未显示）。HPTLC-1结果的初步评估表明，观察到的与自身疾病相关的抗自身聚糖IgG抗体模式与我们样本中最代表的某些神经系统疾病有关：格林巴利综合征中的IgG抗GM1（8中的7； 88％ ）和Miller Fisher综合征中的IgG抗GQ1b（4分之3； 75％）8。
神经系统疾病患者中抗非自身聚糖和抗自身聚糖IgM和IgG亚类抗体的分布。（A）对应于患者＃11的代表性HPTLC-1结果。血清温育后，用于结合检测每种同种型（IgM或IgG）或每种IgG亚类（IgG1，IgG2，IgG3或加入IgG4）。在左板上，用奥西诺尔试剂观察不同的鞘糖脂。（B）在非随机选择的27名抗自身聚糖IgG Ab阳性，神经系统疾病患者中发现了抗非自身聚糖和抗自身聚糖IgM和IgG亚类的摘要。显示了对每个糖鞘脂具有反应性的IgM和IgG抗体亚类的存在（黄色方块）或不存在（蓝色方块）（通过HPTLC-1）。最左列详细列出了患者编号（患者编号）和神经系统疾病诊断（Dx）。ALS肌萎缩性侧索硬化，AMN不对称运动神经病，CIDP慢性炎性脱髓鞘多神经病，DN糖尿病性神经病，GBS吉兰-巴雷综合征，LMND下运动神经元疾病，MFS米勒费雪综合征，MMN多灶性运动神经病，PNS副肿瘤综合征，SMN感觉运动神经病。
对于每个给定抗原组的IgG亚类分布分析，我们绘制了每个IgG亚类阳性血清样品的百分比（将针对该抗原的任何IgG亚类阳性样品的数量视为100％；请参见材料和方法）。抗非自身聚糖IgG抗体的IgG1（p = 0.0078）和IgG2（p = 0.0001）的频率明显更高。相反，抗自身聚糖IgG抗体阳性的血清显示IgG3的存在频率更高（p = 0.0017；图 2）。
与针对非自身聚糖的抗体相比，抗自身聚糖抗体具有不同的IgG亚类分布。对于每个IgG亚类，显示了针对非自身聚糖（蓝色条）和自身聚糖（红色条）中分组的抗原具有抗体反应性的样品的百分比。使用HPTLC-1确定了不同的抗非自身聚糖和抗自身聚糖IgG亚类抗体反应性（**：p ＜0.01； ***：p ＜0.001； Fisher精确检验）。
在不同的血清样品中进行了详细检查，一些IgG抗体反应包含两个或多个不同的IgG亚类，而另一些则由单个IgG亚类形成。对自身聚糖的反应性与单个IgG亚类的存在显着相关（p = 0.0133），因此与对非自身聚糖的反应相比，抗体反应受到的限制更大（图 3）。
对自身聚糖的反应性与更受限的IgG亚类抗体反应有关。堆积的条形图显示了在抗非自身聚糖和抗自身聚糖IgG抗体反应中由单个（“一个”）与多个不同（“两个”，“三个”或“四个”）IgG亚类组成的IgG抗体群体的比例。单个IgG亚类群体的存在被认为指示了更严格的应答（*：p <0.05，Fisher精确检验）。
已经在正常人血清6中报告了识别某些自身带有糖聚糖的鞘糖脂（GM2 / GM1 / GD1b）的IgM群体，这为测试的各种自身聚糖糖鞘脂内的潜在抗体反应差异留下了空间。在此基础上，对反自聚糖糖脂反应性的“反自我聚糖A”（GM2 / GM1 / GD1b）的subgrouped和“反自我聚糖B”（GD3 / GQ1b /神经节苷脂GD1a / GM3 / GT1b，请参见“ 方法 ”）。抗自身聚糖A的IgG1亚类抗体应答比例显着高于抗自身聚糖B亚组（p = 0.0266）。相反，与抗自身聚糖A亚组相比，抗自身聚糖B亚组的IgG3比例明显更高（p = 0.0007；图2）。 4），支持针对自身聚糖的抗体中不同类型的IgG反应的概念。
IgG亚类频率偏向于抗自身聚糖A和抗自身聚糖B反应之间的不同IgG亚类。显示了在自身聚糖A（桃条）和自身聚糖B（紫色条）中分组的抗原的IgG亚类频率分布。使用HPTLC-1确定每个亚类的抗体反应性。（**：p ＜0.01； ***：p ＜0.001； Fisher精确检验）。
无论其特异性如何，都存在一些抗自身聚糖IgG抗体及其IgM对应物，而其他群体则没有其IgM对应物（图 1 B）。因此，基于同时存在或不存在IgM对应物，我们将抗自身聚糖IgG抗体亚类归为不同的抗体亚群。与没有IgM对应物的IgG反应相比，与自身IgM对应物一起存在的抗自身聚糖IgG反应显示出更高比例的IgG2（p = 0.0295；图 5）。
抗自身聚糖IgG抗体反应的IgM对应物的存在与IgG2亚类的频率增加有关。使用HPTLC-I确定了每个亚类检测到的与IgM一起检测到的抗自身聚糖抗体的抗体反应性（条纹条）与没有IgM对应物的抗自身聚糖抗体的反应性（红色填充条）。*：p ＜0.05（费舍尔精确检验）。
即使无脊椎动物能够区分自我和非自我成分，也要等到陆生脊椎动物（两栖动物，爬行动物，鸟类和哺乳动物）的水平才能出现具有胸腺，脾脏，骨髓和淋巴结的完整免疫系统和IgM和IgG抗体制成34。除了它们在宿主防御和体内平衡中的关键作用之外，对抗体生产的不当控制还可能产生针对某些自身抗原（例如聚糖抗原）的抗体并引起自身免疫疾病8。非自我和自我聚糖之间的结构相似性可能表明两种反应之间的联系16。在本工作中，我们表征了一组神经系统疾病患者针对多种非自身和自身鞘糖脂的抗体免疫应答（IgM，总IgG和IgG亚类）。允许两种类型的反应，其中抗非自聚糖IgM抗体被认为是抗菌抗体之间的比较对携带或者非自聚糖鞘糖脂或自聚糖的体液免疫应答的并行评估4，5，35。
正如已经观察到的，抗非自身聚糖IgG抗体始终具有其IgM对应物17，并且呈现出较少受限制的IgG亚类应答（即两个或更多不同的IgG亚类）。显示IgG2和IgG1的作为普遍存在的IgG亚类，它们类似于抗体应答针对细菌聚糖36，37，与IgG2的暗示在TI免疫应答这些抗体群的相关的贡献38。相反，针对自身聚糖的IgG抗体通常表现出更受限制的IgG亚类分布（即单个IgG亚类）和增加比例的IgG3亚类（与T细胞依赖性（TD）免疫反应一致39）。
具有不同生物学特征的三组幼稚B细胞在分化为浆细胞后可形成正常的抗体库群：B-1 B细胞（通常细分为B-1a和B-1b B细胞），滤泡（FO）B细胞和MZ B细胞40。B-1 B细胞（主要位于腹膜和胸膜腔中）产生针对T非依赖性（TI）抗原（例如碳水化合物或磷脂抗原）的IgM抗体41。FO和MZ B细胞（通常称为B-2细胞）存在于次级淋巴器官中。虽然这两个B-2群体可以体验的Ig类别转换和分化成的存储器单元40，42，FO B细胞主要负责产生针对T依赖性抗原的持久，高亲和力IgG抗体40，而MZ B细胞也可以识别TI碳水化合物和磷脂抗原（像B-1细胞一样）42。TI II型免疫反应产生记忆B细胞43。IgM的表达记忆B细胞与IgM的+ IGD + CD27 +表型可在用聚糖抗原，分化到浆细胞和切换它们的同种型激活到的IgG2经历二次生发中心反应44，45。当IgM存在于抗自身聚糖反应中时，我们观察到明显更多的IgG2贡献。与IgG1和IgG3相比，IgG2具有更低的激活补体，诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和触发抗体依赖性细胞吞噬作用的能力20：在IgG2抗自身聚糖的背景下，IgG2与其他IgG亚类竞争抗原结合相对富集可以减少病原体事件，并总体上降低神经系统疾病的严重性。
糖基-抗体相互作用是通过许多具有亲水性和疏水性的吸引力46发生的：相互作用点的获取，修饰或丧失允许出现具有特异性变化的克隆。连续的B细胞活化事件以高速引入单核苷酸变化（〜1突变每10 3碱基对/代）能提供快速BCR多样化47和一些通过体细胞超突变具有潜在的亲和力成熟变体48。在一个过程中，我们将其称为“结合位点漂移”假说16，新的特异性现在可以导致这些抗非自身聚糖抗体与类似于自身聚糖的序列发生交叉反应。细菌驱动的B细胞活化可以扩展这些抗自身聚糖IgG B细胞克隆。达到某个抗体亲和力阈值后，这些B细胞克隆现在可以通过自身聚糖或某些微生物的外来成分（例如空肠弯曲杆菌 LPS O抗原具有类似GM1的寡糖基序）上的自身聚糖寡糖结构激活。GD1a，GD3，GT1a，GQ1b；模仿GM1和GT1a的流感嗜血杆菌；类似于GM2的巨细胞病毒8）。即使聚糖被认为是TI抗原，我们对IgG亚类的发现也表明抗自身聚糖反应可以通过两种机制发展：一种是TI（对于具有IgM对应物的抗自身聚糖），另一种是TD（对于两种类型的抗自身聚糖） ）。T细胞参与确实是一个可能的事件：MZ B细胞可以将脂多糖和糖鞘脂呈递给CD1限制的α/β和γ/δT细胞。通过CD40L–CD40激活和T细胞增殖为增殖和抗体反应提供了背景，最终产生了类别开关49。这不一定会对IgM有害：来自MZ B细胞的IgG抗体反应倾向于维持IgM的产生，即使对于长期记忆的B细胞群体50。
如果抗人自身聚糖IgG抗体在正常人血清中没有IgM对应物，该如何发生？一种可能性是对具有表面IgM的抗自身聚糖（自身反应性）B细胞发起的针对自身聚糖的反应，仅留下携带表面IgG的抗自身聚糖记忆B细胞在此首次反应后仍然保留。我们假设抗自身聚糖IgM +经历“结合位点漂移”过程并被自身聚糖激活的B细胞克隆种群将有机会扩增。然后，某些选定的B细胞克隆可以将其同种型更改为一些不同的IgG亚类，总体上导致除IgM之外还引发了两个或多个IgG亚类。相反，源自IgG水平的“结合位点漂移”事件的克隆已被确定为IgG亚类。因此，那些克隆之一的扩增将仅从该特异性IgG亚类产生抗自身聚糖抗体，而没有抗自身聚糖IgM抗体或其余的IgG亚类。与抗自身聚糖IgG抗体相比，这可以解释观察到的针对抗非自身聚糖IgG抗体的较少的受限制的IgG亚类分布。 6。
在自身聚糖和非自身聚糖之间，IgG抗体亚类反应在质量上是不同的。趋势与每个同种型和子类的百分比分布成比例显示。TI T非依赖性抗体应答，TD T非依赖性抗体应答。
在抗自身聚糖IgG抗体反应性内（显示IgG3亚类比例增加，即TD反应），识别“自身聚糖B”亚组的抗体的IgG3比例明显高于针对“自身聚糖A”亚组的抗体，这表明来源不同。重要的是要注意，“自身聚糖B”亚组（GM3 / GD3 / GD1a / GT1b / GQ1b）包含糖鞘脂，其携带与末端半乳糖（NeuNAcα2,3Gal）结合的N-乙酰神经氨酸（NeuNAc）。这是有关抗自身聚糖抗体特异性的非常重要的因素：例如，针对GM 1的抗体（“自身聚糖A”亚组的一部分）需要游离末端半乳糖和（在某些患者中）内部NeuNAc才能结合，使其无法与带有末端NeuNAc的自身聚糖（“自身聚糖B”）发生交叉反应。IgG1- / IgG3-亚类比例的不平衡可能会对病理学发展产生影响，因为IgG3-亚类比IgG1 25具有更好的补体激活能力，尽管其血浆半衰期缩短了三倍20。考虑到针对终末NeuNAcα2,3Gal表位的抗体已优先与轴突损伤相关联51，可以推测IgG3较高的生物活性可能会对Guillain-Barré综合征的轴突形式（与脱髓鞘变体相比）的严重性和恢复较慢产生影响52。
抗自身聚糖抗体是多因素过程中的重要组成部分，该过程定义了某些神经系统疾病的临床发展。来自具有抗GM1 IgG抗体的GBS患者的证据表明，尽管不同的患者表现出不同的抗GM1抗体精细特异性，但他们并没有同时出现太多不同的人群53。我们可以认为它们一起代表了抗体特异性变化的不同可能性，并假设不同的抗自身聚糖IgG抗体群体的出现是由随机过程引起的，并且将这种观点扩展到了其他抗自身聚糖IgG介导的神经系统疾病。正如我们之前讨论的，在“结合位点漂移”假说的背景下，我们可以潜在地预见到同一自身聚糖靶标的不同类型的抗体反应。一种反应源自抗自身聚糖IgM +现已漂移并已被自身聚糖激活的B细胞群体可导致某些IgM克隆改变其同种型，从而以TI响应（主要为IgG2）和TD响应（主要为IgG1和IgG3）的组合产生各种不同的IgG亚类。相反，抗自身聚糖IgG +在IgG水平漂移（在TD响应中那些克隆之一的扩增后）的B细胞克隆（已经确定的IgG亚类）将仅成为该特定IgG亚类。根据每个IgG亚类表现出的生物学活性差异，所产生的IgG亚类应答的差异可能对疾病的严重程度，对治疗的应答和/或恢复时间具有临床意义，因为已观察到与抗-IgG相关的GBS的恢复较慢。 GM1 IgG1抗体32。有必要进行进一步的研究，以探索不同类型的针对自身携带的糖鞘糖脂的IgG亚类应答对其他自身免疫性神经系统疾病的临床影响。
在接受任何免疫治疗之前，先从“ RamosMejía”医院和国家医院“Joséde SanMartín”（阿根廷布宜诺斯艾利斯）的神经病患者那里进行免疫治疗，然后收集这些疾病的血清标本，这些疾病具有神经病的早期症状。血块分离后，将血清送至我们的实验室进行抗糖鞘脂抗体（GM1，GM2，GM3，GD1a，GD1b，GD3，GT1b，GQ1b）的常规测定。从样本中获得针对这些自糖基携带的糖鞘脂中任何一种的IgG抗体阳性的样本，我们随机选择27例患者进行进一步分析（肌萎缩性侧索硬化，n = 2；不对称运动神经病，n = 2，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病，n = 1 ，糖尿病性神经病，n = 1; Guillain-Barré综合征，n = 8；下运动神经元疾病，n = 2；Miller Fisher综合征，n = 4；多灶性运动神经病，n = 1；副肿瘤综合征，n = 1；感觉运动神经病，n = 5）。与不同的程度，所有这些神经病症已被报道存在自身免疫性部件8，54，55。所有程序均根据涉及人类受试者的研究道德准则进行56并遵循1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案所规定的道德标准，并得到CIQUIBIC-CONICET道德委员会的事先批准。从患者获得知情同意。
糖鞘脂得自以下生物材料：桑霍夫病人脑中的GM2；狗的GM3红细胞；GD3的鸡脑；人脑中的GM1，GD1a，GD1b，GT1b和GQ1b；Forssman糖鞘脂的绵羊红细胞（Forssman）；人体血液基团“A”为胎粪血型‘A’鞘糖脂; 丽蝇为NT7蛹鞘糖脂57从分区脂质提取物Folch上层相。58使用DEAE -chromatography依次纯化59和HPLC在Iatrobeads硅胶柱60酸。水解牛脑神经节苷脂制备去唾液酸GM1（GA1）61，脂蛋白纯度用HPTLC和奥西诺尔试剂检测。
HPTLC与随后的免疫检测（HPTLC-I）表示的“黄金标准”来检测抗糖脂抗体和自身反应性确认结果62，63。使用设计用于获得高度可重现色谱图的罐64，将糖鞘脂（每个0.3 nmoles）在运行溶剂氯仿-甲醇-含水0.2％CaCl 2中的HPTLC板上分离。（45:45:10）。将板风干，并通过将其浸入0.5％的聚甲基丙烯酸异丁酯（Plexigum P 28，Röhmand Haas，德国达姆施塔特，德国）在正己烷-氯仿（9：1）中的溶液浸涂2分钟。用BSA-PBSt（含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液中的1％牛血清白蛋白）封闭1小时后，将板与BSA-PBSt稀释的血清（1/20）孵育过夜，并用PBSt彻底洗涤。在与BSA-PBSt稀释（1 / 1,000）过氧化物酶结合的抗人IgM（μ链）或IgG（γ链）山羊抗体（Sigma，美国）孵育2小时后，检测到结合。为了确定IgG亚类，将BSA-PBSt稀释的针对人γ1（IgG1），γ2（IgG2），γ3（IgG3）oγ4（IgG4）链（Sigma，USA）的生物素偶联抗体孵育2小时，然后孵育1小时PBSt稀释的过氧化物酶结合的链霉亲和素（Sigma，美国）孵育。所有孵育步骤均在4°C下进行。洗涤后，在含有2.8 mM 4-氯-1-萘酚和0.01％H的底物溶液中实现了显色在甲醇20 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.4（1:29）中加入2 O 2。最后在20分钟后用PBSt洗涤板以终止反应。使用ImageJ软件（1.52版）对免疫染色结果的数字图像进行定量，并在将最小峰面积阈值设置为500时将其转换为分类数据。
报告为分类数据的抗体反应性出于统计目的被分组。针对非自身聚糖（GA1，Forssman，Nt7和针对“ 0”和“ B”血型个体的血型“ A”糖鞘脂）的免疫染色被归类为“非自身聚糖”反应性。正常人血清6中存在针对GM1，GD1b和GM2的IgM种群; 因此，针对GM1，GD1b和GM2的IgG反应性有时被视为一个亚组（“自身聚糖A”）。最后，针对GM3，GD3，GD1a，GT1b和GQ1b的IgG反应被算作自身聚糖的另一亚组（“自身聚糖B”）。对于每个给定的抗原组，通过将每个IgG亚类的阳性样本数与针对该抗原的总IgG抗体阳性的样本数（视为总样本数）进行比较，进行IgG亚类分布分析。数据通过Fisher的Prism 6精确测试（GraphPad软件，加利福尼亚州拉霍亚）进行检查。与差异P值<0.05被认为是显著。统计显着性程度表示如下：*，p <0.05；**，p <0.01；***，p <0.001，或****，p <0.0001。
含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水
PBSt中含1％牛血清白蛋白
GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glcβ1-Cer
GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα1-4GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Manβ1-4Glcβ1-Cer
GalNAcα1-（Fucα1,2）3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer
Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-Cer
NeuNAcα2-3Galβ1-4Glcβ1-Cer
NeuNAcα2-8NeuNAcα2-3Galβ1-4Glcβ1-Cer
GalNAcβ1-（NeuNAcα2,3）4Galβ1-4Glcβ1-Cer
Galβ1-3GalNAcβ1-（NeuNAcα2,3）4Galβ1-4Glcβ1-Cer
NeuNAcα2,3Galβ1-3GalNAcβ1-（NeuNAcα2,3）4Galβ1-4Glcβ1-Cer
Galβ1-3GalNAcβ1-（NeuNAcα2,8NeuNAcα2,3）4Galβ1-4Glcβ1-Cer
NeuNAcα2,3Galβ1-3GalNAcβ1-（NeuNAcα2,8NeuNAcα2,3）4Galβ1-4Glcβ1-Cer
NeuNAcα2-8NeuNAcα2,3Galβ1-3GalNAcβ1-（NeuNAcα2,8NeuNAcα2,3）4Galβ1-4Glcβ1-Cer
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