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纳米级基于金属有机框架的疫苗协同作用与PD-1阻断,增强抗肿瘤免疫力

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发表时间:2020-08-03 16:07作者:武汉新启迪生物Xinqidibio来源:www.qidibio.com

纳米级基于金属有机框架的疫苗协同作用与PD-1阻断,增强抗肿瘤免疫力

近年来,检查站封锁疗法已在多种癌症中提供了显着的益处。但是,它的临床益处仍然局限于成本极高的患者的10%至40%。在这里,我们设计了一种超快速,低温且通用的自组装路线,将免疫学相关的大分子整合到金属有机骨架(MOF)门控介孔二氧化硅(MS)中作为癌症疫苗。核心MS纳米颗粒充当内在的免疫增强剂,可提供小生境,空隙和空间来容纳抗原,可溶性免疫增强剂等,而MOF守门员则保护内部免受强力和脱靶释放。+ T细胞反应,逆转免疫抑制途径并诱导持久的肿瘤抑制。

介绍

检查点阻断治疗的临床益处的重燃癌症免疫疗法,希望12345但是,由于程序性细胞死亡1(PD-1),细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的检查点封锁疗法的客观缓解率仍然约为10-40%到多个免疫抑制因子,如T细胞排斥,免疫抑制细胞,剥夺肿瘤浸润淋巴细胞和新抗原,以及负调节标记和细胞因子12345另一方面,检查站封锁疗法的费用高昂,给患者和社会带来了巨大的经济负担6最重要的是,用抗体(ABS)的全身给药检查点封锁与免疫相关的不良事件,包括细胞因子风暴,并在长期的自身免疫性疾病的风险相关联的1278

拓宽临床益处和最小化的治疗成本,使用的组合的癌症免疫疗法的被认为是癌症治疗的未来方向3591011121314组合的癌症免疫疗法,其同时“解除免疫断”使用免疫检查点抑制剂和“按压免疫加速器”通过刺激抗原呈递,这因此素和激活效应T细胞应答,会比单一疗法更有效35910111213也就是说,当与免疫检查点抑制剂组合给予时,刺激抗原呈递和T细胞引发的合适的癌症疫苗有望使剂量,治疗费用以及免疫检查点抑制剂引起的不良事件的风险最小化。由于在检查点阻断治疗的响应率依赖于T细胞免疫 15,癌症疫苗的组合可以通过加强癌症抗原的免疫原性,引发并放大特异性T细胞免疫应答向癌抗原提高响应速度 91011121315161718

对于成功的癌症疫苗,整合癌症抗原和免疫增强剂的佐剂的合理设计至关重要,因为单独使用这些成分可能会导致全身非特异性免疫反应和严重的副作用19大多数癌症疫苗采用癌抗原和免疫增强剂的混合物具有或不具有车辆9101112131516但是,它们具有初始爆发和脱靶释放的问题,导致疫苗接种效率降低。为了实现癌症疫苗的全部功效,佐剂必不可少的要求包括:(1)有效封装癌抗原和免疫增强剂,以防止其初始爆发释放并实现其控释;(2)靶向递送至抗原呈递细胞(APC)和淋巴结转移(3)塑造有效的抗肿瘤T细胞反应,以及(4)良好的生物相容性。要满足所有这些要求并不容易。通过金属有机骨架的优异仿生矿化封装能力(MOF)用于生物分子的启发202122和介孔二氧化硅(MS)的优异固有免疫整形特性2324,我们制造了MOF门控MS(MS @ MOF)的基础上实现靶向递送至APC和淋巴结,并导航抗肿瘤免疫力上nanoadjuvants。

在这里,我们提出了一种超快速,低温,通用的自组装途径,将癌症抗原和免疫增强剂整合到由MS作为核心容器和MOF作为关守者组成的每个纳米颗粒中,以制造MS @ MOF癌症疫苗作为神奇的子弹。用于联合癌症免疫治疗。带有pH开关按钮的癌症疫苗的集成制剂可以实现靶向抗原,受控和有效的抗原(卵清蛋白,OVA)和免疫增强剂(聚肌苷酸-聚胞苷酸,polyIC)的代码传递,以引流淋巴结,提高其可用性并最大程度地减少脱落目标效果。此外,MS @ MOF癌症疫苗,在全身检查点封锁组合在PD-1单一疗法封锁的仅仅10%的剂量91125,具有协同作用,可以逆转免疫抑制肿瘤的微环境,引发强大的适应性癌症抗原特异性免疫反应,并有效诱导荷瘤小鼠的持久肿瘤抑制。

结果

MS @ MOF纳米佐剂的分层自组装合成

MS @ MOF自由在不同MS至MOF比浸渍在含有Zn溶液MS合成抗原和免疫增强剂分子的2+。在0℃下和2-甲基咪唑15分钟(图   1 ;补充图   1 - 4)。MS表现出星状孔道和高达35 nm的树状打开的门(补充图   1a,b)。当Zn 2+和2-甲基咪唑的浓度低时,MOF沉淀到MS中星状孔道的内壁上并形成薄层。随着Zn 2+的增加和2-甲基咪唑浓度或降低的MS浓度,沉淀的MOF量逐渐增加,填充孔道并阻塞开门。极高的Zn 2+和2-甲基咪唑浓度溶液或低的MS初始量会导致MS纳米颗粒聚集为一个大颗粒(图   1a,b)。扫描电子显微镜(SEM)图像显示,随着MOF量的增加,MS @ MOF的形状逐渐从孤立的约100 nm纳米球改变为聚集的约500 nm纳米复合物(图   1b;补充图2图   3))。与无定形硅石相比,广角X射线衍射(WAXRD)图谱显示MS @ MOF中ZIF-8 MOF相的结晶度,其强衍射峰在7.3、10.4、12.7、14.6、16.4和18.0°附近MS的液相色谱峰,在〜23°处有一个宽峰(图   1c)。MS @ MOF的流体动力学直径随着MOF量的增加而从100纳米增加到1200 nm,这是通过动态光散射(DLS;图   1d)确定的。在磷酸盐缓冲液[PBS(-)]中,MS @ MOF的zeta电位集中在-18 mV,而MS和MOF的zeta电位分别在-16和-24 mV左右(补充图   4a)。MS,MS @ MOF和MOF的比表面积分别为526、323和1098 m 2 / g(补充图。 4b–d)。MS的平均孔径为13.2 nm,足以吸附生物分子。相反,MOF的平均孔径较小,约为1.6 nm,这使其可用作保护内部免受强力释放的守门员。扫描透射电子显微镜(STEM)图显示了Zn 2+元素从外部到内部在MS的完全发射通道中的均匀分布(图   1f)。

图1:MOF门控的MS纳米助剂的分层自组装合成。
图1

a MS和MOF门控MS纳米结构示意图,b MS和MOF门控MS的MS / MOF比不同的SEM和TEM图像(0.166 M MS,0.069 M Zn 2+ ; 0.166 M MS,0.207 M Zn 2+;和0.166 M MS,0.414 M Zn 2+)。比例尺,200 nm(上部,SEM); 100 nm(向下,TEM)。c MS,MOF门控MS和MOF的XRD模式。d具有不同MS / MOF比(0.166 M MS,0.069 M Zn 2+ ; 0.166 M MS,0.207 M Zn 2+ ; 0.166 M MS,0.414 M Zn 2+的MOF门控MS的粒度分布e SEM图像和fMOF门控MS的STEM映射(合成参数:0.1 M MS,0.276 M Zn 2+)。e中的比例尺,100 nm。f的比例尺,50 nm。

还制造了MOF门控的MOF(MOF @ MOF)作为对照(补充图   56)。首先,使用Zn 2+(0.69 M)和2-甲基咪唑(3.13 M)溶液制备〜100–200 nm的MOF核在第二步中,通过将MOF核浸入Zn 2+(0.138、0.276和0.345 M)和2-甲基咪唑(0.626、1.252和1.565 M)溶液中形成MOF @ MOF 通过在第二步中更改Zn 2+和2-甲基咪唑的浓度,我们可以相应地调整获得的MOF @ MOF的壳厚度和聚集状态。

MOF门控MS封装模型抗原和分子免疫增强剂

由于MOF在低温下在MS上的覆盖生长,MOF门控的MS将模型抗原和分子免疫增强剂封装并固定到MS的开放孔道中。首先,MOF的封装能力,通过简单地补充OVA和聚IC进入研究的Zn 2+和2-甲基咪唑水溶液(补充图   7 - 12)。OVA被有效封装到MOF(OVA MOF)。将OVA浓度从0增加到25 mg / mL不会影响形成的MOF的粒径,将其维持在100–200 nm范围内。OVA的XRD图谱具有各种OVA浓度的MOF表现为ZIF-8相。当OVA浓度为25 mg / mL时,MOF中OVA的包封效率为〜75%。此外,聚IC封装到MOF以获得聚IC MOF,其表现出在的ZIF-8相的100-200纳米和X射线衍射图案的范围内的粒度,相似于那些OVA的 MOF。在25和5 mg / mL的polyIC下,MOF中polyIC的封装效率分别约为55%和80%。

然后,将多功能生物分子(模型抗原,分子免疫增强剂和检查点抑制剂抗体)与MOF在MS上的生长结合,通过分级自组装封装在MS的开放孔通道中,以制造MOF门控的MS癌症疫苗。在典型的合成中,首先将分散良好的MS纳米颗粒首先浸入含OVA的水溶液中以充分吸附OVA,然后将Zn 2+和2-甲基咪唑添加到溶液中,以 MS的星状通道内的MOF中形成内部OVA 命名为MS @(OVA MOF)。在第二步骤中,将获得的MS @(OVA MOF)粒子浸渍在含有任一抗CTLA4抗体或聚IC,Zn的水溶液2+和2-甲基咪唑,制作(MS @ OVA MOF)@(抗CTLA4 MOF)或(MS @ OVA MOF)@(聚IC MOF)。从标准曲线计算出抗CTLA4 Ab在MOF门控MS中的包封效率约为100%(补充图   13)。PBS(-)中的OVA,抗CTLA4 Ab和polyIC的ζ电势分别约为-9.5,-2.5和-27 mV(补充图   14)。MS的ζ电位@(OVA MOF)为〜-16毫伏。在第二步骤之后,(MS @ OVA的ζ电位 MOF)@(抗CTLA4 MOF)和(MS @ OVA MOF)@(聚IC MOF)分别移至约-10和-25 mV。zeta电位的变化反映了将各种生物分子成功封装到MOF门控MS中的情况。

我们通过XRD,SEM和TEM分析评估了不同批次制造方法的可重复性(补充图   15)。结果表明,不同批次样品的形貌和粒径高度均匀,无明显差异。MS @(OVA MOF),(MS @ OVA MOF)@(聚IC MOF)和(MS @ OVA MOF)@(抗CTLA4 MOF)从不同批次合成表现出与类似的ZIF-8 MOF相在WAXRD图案中,强衍射峰分别位于7.3、10.4、12.7、14.6、16.4和18.0°。MS @(OVA MOF),(MS @ OVA MOF)@(聚IC MOF),和(MS @ OVA MOF)@(抗CTLA4 MOF)显示出类似的纳米球的形态和〜100纳米的尺寸。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,补充图16进一步证实了纳米助剂中药物的存在   OVA加载nanoadjuvants并将它们悬浮在水中,包括免费OVA,OVA后对应上清液样品 MS,MS @(OVA MOF)和OVA MOF,进行了测试。在本文中,OVA溶液与MS混合以制备OVA MS。对于游离OVA的上清液,清楚地检测到OVA带。对于MS 的OVA上清液,由于OVA分子从MS上部分解吸,OVA的带变弱。相反,MS @(OVA)的上清液在SDS-PAGE中未检测到明显的OVA条带。 MOF)和OVA MOF,表明OVA和载流子(补充图之间的强亲和力   16A)。此外,OVA加载nanoadjuvants,包括OVA MS,MS @(OVA MOF),和OVA MOF,显示OVA的频带显然是在SDS-PAGE类似于游离OVA组,表明OVA的在存在纳米佐剂(补充图   16b)。

我们开发了一种超快速,低温,通用水相途径,以经济高效的方式结合MOF的低温生长,将高分子量的癌症抗原和免疫增强剂封装到MS的星状孔通道中。在MS中,孔径高达35 nm的开放和星状孔隙通道以及随后的MOF捕获生物分子的结晶提供了将多种高分子量生物分子容纳和封装到MOF门控MS中的可能性。尽管通过逐层自组装过程将多个生物分子封装在一个MOF门控MS粒子中,但它们也可以通过一锅法封装。本发明的合成技术对于癌症疫苗是非常重要的,因为使用多种生物分子的组合对于根除已建立的肿瘤至关重要。这种MOF门控策略不仅适用于MS纳米颗粒,而且适用于MS支架和其他纳米材料。

PH敏感降解和MOF门控MS释放生物分子

纳米佐剂的可降解性是未来临床应用要考虑的关键参数。在这里,我们综合评价MOF门控MS的降解特性和生物分子释放特性(图   2A-E ;补充图   17 - 21)。MS随时间逐渐降解为硅酸,而MOF降解为Zn离子和咪唑化物。MS的降解轮廓@(OVA MOF)或MS @ MOF通过在醋酸盐缓冲液(pH = 5)和Tris-HCl缓冲液(pH = 7.4)电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)分析。OVA MOF和OVA 的降解特性还研究了MS作为对照。在中性缓冲液中,MS @ MOF表现出缓慢且持续的Zn离子释放,并且在1天内的初始释放速率低至〜11μg/ mL,随后在8天内的累积释放速率高达约23μg/ mL。另一方面,在乙酸盐缓冲液中,在1天之内观察到了高达约49μg/ mL的Zn离子的爆发释放。MS @(OVA MOF)和OVA MOF显示在Zn释放到MS @ MOF了类似的趋势,虽然OVA MOF显示在中性缓冲液中的更快的Zn释放比其他两个。MS @ MOF,MS @(OVA MOF)和OVA 尽管中性缓冲液中的Si释放比乙酸盐缓冲液中的Si释放快,但MS证明了中性和乙酸盐缓冲液中Si离子的持续释放。此外,还使用添加了10%血清的Tris-HCl缓冲液来测试MOF门控MS的降解行为。总体而言,补充血清的缓冲液的降解曲线与纯缓冲液的降解曲线相似(补充图   20a,b)。

图2:纳米佐剂的降解和生物分子释放,以及体外BMDC的活化。
图2

ab pH响应的MS,MOF门控MS和MOF降解(n  = 3个独立样品);Ç OVA释放从OVA MS,MS @(OVA MOF)和OVA MOF在不同pH值(Ñ  = 4个独立样本); d从聚IC聚IC释放 MS,MS @(聚IC MOF)和聚IC MOF在不同pH值(Ñ  = 3个独立样品)。È MS的方案@(聚IC MOF)制造和其下不同pH值释放。F共聚焦激光扫描自由FOVA,FOVA的细胞摄取的显微图像 MS,MS @(FOVA MOF)和FOVA 通过的BMDC MOF。赫斯特,蓝色;fOVA(癌症模型抗原),绿色。比例尺,10μm。g在第1天与不同的纳米佐剂一起培养时BMDC分泌的IL-1β和TNF-α(n  = 8个独立样品,单向ANOVA,随后经过hokey测试进行Tukey多重比较;IL-1β,p  <0.0001;TNF-α ,p  <0.0001)。在所有的数据 - d表示为平均值±SD数据在表示为平均值+ SD

从MOF门控MS释放生物分子显示出与MOF门控MS降解相同的趋势。OVA MOF和MS @(OVA MOF)表现出中性缓冲OVA的缓慢和持续释放,而它们显示OVA的在乙酸盐缓冲液(图爆发释放   2C,附图   1718)。类似地,聚IC MOF和MS @(聚IC MOF)表现出聚IC的在中性缓冲液中的缓慢和持续释放,和聚IC的在乙酸盐缓冲液(图爆发释放   2D,补充图   19)。OVA MS和聚IC MS在中性和乙酸盐缓冲液中均显示OVA或polyIC的爆发释放(图   2c,d)。缓冲液中血清的存在不会显着影响MOF门控MS释放生物分子的情况(图   2c,d;补充图   20c,d)。在这里,用铁蛋白代替OVA来研究血清中蛋白质的释放。在Tris-HCl缓冲液补充了10%血清,铁蛋白 MOF,聚IC MOF,MS @(铁蛋白 MOF)和MS @(聚IC MOF)显示铁蛋白或聚IC的缓慢和持续释放,而铁蛋白 MS和聚IC MS示出了爆发释放。

MOF门控MS在中性缓冲液中缓慢降解和在乙酸盐缓冲液中突发降解有利于防止抗原和免疫增强剂在细胞外环境中过早释放,并促进它们向细胞内环境中的递送。MOF门控的MS包封生物分子表现出生物分子的pH响应释放,在中性缓冲液中缓慢释放,而在乙酸盐缓冲液中快速释放。另外,锌的用OVA协调增强OVA的保留在MS @(OVA MOF)或OVA MOF,这是OVA释放速度比其他分子慢的原因。以pH响应方式控制MOF门控MS的降解和释放可以促进抗原递送,抗原呈递和引发抗肿瘤T细胞免疫。pH响应的内溶酶纳米佐剂有助于抗原从内体/溶酶体逃逸到细胞质,并随后与主要组织相容性复合物(MHC)I分子26相关的交叉呈递在这里,MOF门控的MS表现出生物分子的pH响应释放,而在中性缓冲液中缓慢释放,而在酸性缓冲液中则快速释放,这表明基于MOF门控MS的疫苗接种具有增强癌症抗原交叉呈递的潜力。 CD8 + T细胞。

体外树突状细胞的细胞摄取,活化和抗原呈递

我们首先检查了MOF门控MS对细胞摄取和APC激活的影响,因为APC的激活是启动适应性免疫应答的第一步。在这里,荧光素缀合的OVA(fOVA)被用作模型抗原。骨髓的树突细胞(BMDC的)用FOVA培养 MS,MS @(FOVA MOF),和FOVA MOF使用FITC缀合的OVA(FOVA)或OVA的对应调查nanoadjuvants对细胞摄取和活化的作用的BMDC的体外(图   2F,克 ;补充图   22 - 24)。培养基,游离的fOVA和OVA用作对照。游离的fOVA组显示FITC发出的绿色荧光非常弱,而fOVA MS,MS @(FOVA MOF),并FOVA MOF组显示出强烈的绿色荧光。与自由FOVA,FOVA共培养后的BMDC的平均荧光强度 MS,MS @(FOVA MOF)和FOVA MOF 47,4594,分别14383和8956,(图   2F,补充图   22)。MS,MS @ MOF或MOF的存在促进了BMDC分泌白介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α(图   2g)。的OVA 的MS和MS @(OVA MOF)刺激分泌更多的IL-1β从BMDC的比游离OVA和OVA MOF。MS @(OVA MOF)刺激从比的BMDC OVA,OVA多种TNF-α的分泌 MS和OVA MOF。共培养的BMDC与MS @(OVA MOF)显示显著增加MHC-I +,MHC-II +,CD80 +,CD40 +,和CCR7 +细胞群与那些与游离OVA培养相比。共培养的BMDC与MS @(OVA MOF)显示最高的MHC-I +,MHC-II +,CD80 +和CCR7 +所有群体中的细胞群体。 MOF中与OVA共培养的BMDC 显示出较高的CD40 +细胞群比那些与游离OVA培养,OVA MS和MS @(OVA MOF)(补充图   2324)。APC表面的MHC I和MHC II分子介导抗原呈递。上MHC I分子的外源抗原的交叉呈递是必要的引发CD8 + T细胞应答和抗肿瘤中起着免疫至关重要的作用1827趋化因子受体CCR7在介导APC归巢至淋巴结中起着重要作用。与MS或MOF相比,MOF门控的MS最有效地增强了癌症抗原的呈递,上调了共刺激分子(CD40和CD80)的表达并促进了趋化因子受体CCR7的表达,这暗示了它们在癌症疫苗中的巨大潜力。

为了研究生物分子加载方式对BMDC活化的影响,比较了通过共沉淀(MOF-en)吸附fOVA或OVA的MOF(MOF-ad)和封装了fOVA或OVA的MOF(补充图   2526))。与MOF-ad组相比,MOF-en组的BMDCs表现出更高的细胞摄取fOVA以及更高的TNF-α和IL-1β分泌。这些结果表明,通过共沉淀将生物分子封装到MOF中要优于将生物分子简单吸附到MOF表面上。这一发现进一步支持了上述结果,即MOF门控MS表现出比MS高得多的BMDC刺激能力。

体内MOF门控MS延长了保留时间,增强了向淋巴结的递送并促进了抗原的交叉呈递

接下来,我们研究了使用Alexa Fluor 647缀合的OVA(A647-OVA)作为模型癌症抗原能否长期保留癌症抗原(图   3a–d)。自由A647-OVA和MS的平均荧光强度@(A647-OVA MOF)基团,在注射部位是可比较的,在6小时。所述MS @(A647-OVA MOF)组倾向于在1天和3天,以显示平均荧光强度比游离A647-OVA高两倍。

图3:抗原保留在疫苗接种部位并输送至淋巴结。
图3

一个 MS的方案@(A647-OVA MOF)制造。b时间轴自由A647-OVA和MS @(A647-OVA的注入 MOF),和IVIS观察。Ç在通过IVIS荧光成像系统,用于免费A647-OVA(上)和MS @(A647-OVA观察到注射部位的A647-OVA模型癌抗原残基代表性图像 MOF)(低位)。d在6 h,1天和3天时对注射部位的A647-OVA荧光强度进行定量分析(n  = 3只独立的动物; Student's t检验,两尾)。È MS @方案(FOVA MOF)制造。F注射游离fOVA和负载fOVA的纳米佐剂的时间表以及随后收集的淋巴结以进行冷冻切片和流式细胞术分析的时间表。小鼠淋巴结的代表性冷冻切片图像与接种:FOVA,FOVA MS,MS @(FOVA MOF)和FOVA MOF。DAPI,蓝色;fOVA,绿色。比例尺,50μm。ħ的CD11c的代表性流式细胞术图(左)和群(右)+ MHC-I +树突状细胞在小鼠淋巴结抗原交叉呈递与免疫接种:FOVA,FOVA MS,MS @(FOVA MOF)和FOVA MOF(n = 3个独立样本,进行单向方差分析,然后进行事后检验进行Tukey多重比较,p  <0.0001)。所有数据(dh,右面板)均以平均值+ SD表示

为了分析APC捕获癌抗原并将其转移至引流淋巴结的能力,皮下注射了装有fOVA的MOF门控MS,然后在注射后16 h观察引流淋巴结的冷冻切片(图   3e–g;补充图   27)。游离的fOVA组用作对照。在淋巴结的冷冻切片的绿色荧光强度是用于FOVA高得多 MS,MS @(FOVA MOF)和FOVA 比自由FOVA组MOF基团。为了分析在体内,MS @(A647-OVA MOF门控MS的分布 MOF)在小鼠中的器官用IVIS和ICP-AES分析(补充图检查。   28)。从IVIS图像,MS @(A647-OVA MOF)主要积累在附近的淋巴结,而其量是在其他器官,包括脾,肺,心脏,肾脏和肝脏可以忽略不计。小鼠施用与MS @(A647-OVA MOF)示出在附近的引流淋巴结中平均荧光强度,Si含量和Zn的含量的增加显著与对照组相比。此外,使用与H-2Kb结合的抗小鼠OVA257-264(SIINFEKL)肽,通过流式细胞术分析了DC的MHC I上OVA表位的交叉展示。FOVA的纳米微粒制剂 MS,MS @(FOVA MOF),或FOVA MOF诱导更大的CD11c的号码的生成+ MHC-I+在比自由FOVA淋巴结的DCs。所述MS @(FOVA MOF)示出了抗原交叉呈递的所有组中最高的效率(图   3H)。

有效适应性抗肿瘤免疫应答依赖于远端注射部位的癌症抗原的持久性,所述周和引流淋巴结,和随后的抗原呈递到T之间的及时免疫细胞通信淋巴结细胞2829303132在注射位点的佐剂中的抗原的延长的保留被认为是至关重要的确保DC的长期刺激打破免疫耐受282930313233在这里,封装在MOF门控MS中的A647-OVA与游离A647-OVA相比,在注射部位的保留时间要长得多(图   3a–d);因此,A647-OVA包封MOF门控MS内促进DC的长期刺激和活化和休息朝癌症的免疫耐受的抗原16282930313233

异种移植物中的预防性疫苗

为了评估在预防性肿瘤模型MOF门控MS的效果,(MS @ OVA MOF)@(抗CTLA4 MOF)癌症疫苗,其包括癌症模型抗原(OVA)和抗CTLA4抗体,被制造成使用E.G7-OVA淋巴瘤检查抗肿瘤功效(图   4;补充图   29)。小鼠(MS @ OVA免疫 MOF)@(抗CTLA4 MOF)显示出更高的比率无肿瘤小鼠的,显著较高的存活率,并显著较小肿瘤体积比那些(OVA施用 MOF)@(ANIT -CTLA4 MOF),不含OVA的抗CTLA-4,只有盐水。在(MS @ OVA MOF)@(抗CTLA4 MOF),(OVA MOF)@(ANIT-CTLA4 MOF)和不含OVA的抗CTLA4基团,抗CTLA4抗体(20微克/小鼠)的剂量低至1/10常规剂量。小鼠免疫接种(MS @ OVA MOF)@(抗CTLA4 MOF)表明四聚体的最高人口+ CD8 + T细胞在脾和肿瘤位点和最高细胞因子含量在脾(IFN-γ和TNF-α α)在所有组中(图   4)。值得注意的是,不含OVA的抗CTLA4和(OVA之间的比较 MOF)@(ANIT-CTLA4 MOF。;图   4),或游离OVA和OVA之间。MOF(补充图   30)表明,只有MOF在无进展生存期,总体生存期或肿瘤体积方面没有明显改善。

图4:在预防性小鼠模型中的抗肿瘤活性和肿瘤特异性免疫应答。
图4

一个(MS @ OVA的方案 MOF)@(抗CTLA4 MOF)制造。b实验时间表:雌性C57Bl / 6J小鼠在0、3和10天分别经皮下注射癌症疫苗至左胁腹3次,用5×10 5细胞小鼠-1的E.G7-OVA细胞攻击在第14天右翼并监测疫苗是否抑制肿瘤生长。1#盐水组;2#游离OVA-抗CTLA4组(OVA,100μg/小鼠;抗CTLA4 Ab,20μg/小鼠); 3#(OVA MOF)@(ANIT-CTLA4 MOF)组(OVA,100微克/小鼠;抗CTLA4抗体,20微克/小鼠; MOF,600微克/小鼠); 和4#(MS @ OVA MOF)@(抗CTLA4 MOF)(OVA,100μg/小鼠;抗CTLA4 Ab,20μg/小鼠; MS @ MOF,600μg/小鼠)。Ç(MS @ OVA MOF)@(抗CTLA4 MOF)防止肿瘤的发生,延长的存活率,抑制肿瘤的生长。皮下攻击E.G7-OVA细胞进入疫苗接种小鼠的右胁腹后,无肿瘤小鼠的Kaplan–Meier曲线(左)和小鼠存活率(中)和肿瘤体积曲线(右)(n  = 7只独立的动物;左) ,中间,对数秩;右边,双向ANOVA)。df Tetramer + CD8 +的代表性流式细胞仪图(de)和种群(f终点处脾细胞和肿瘤部位中的T细胞(n  = 4只独立的动物,单向方差分析,然后在hoc测试后进行Tukey多重比较;脾细胞,p  <0.0001;肿瘤,p  = 0.0036)。g脾脏中IFN-γ和TNF-α的含量(1#,2#,n  = 6只独立动物; 3#,4#,n  = 7只独立动物;单向方差分析,然后进行hoc测试后进行Tukey多重比较; IFN-γ,p  <0.0001;TNF-α,p  = 0.0058)。所有数据(c,右面板;f,g)均以平均值+ SD表示

在这项研究中,MOF门控的MS诱导的抗肿瘤功效要高于不含MS的MOF佐剂,具有同等重量,这表明MS是刺激抗肿瘤免疫力的决定性因素24MS触发抗肿瘤免疫力,这是从不仅其用作抗原和immunopotentors的载体,而且其内在免疫调节作用衍生的2324这里应该提到的是,本研究中使用的质谱与先前报道的中空质谱23的孔径(当前和以前的质谱分别为数十nm和3–6 nm)和颗粒形态有很大不同,因此很明显保留和释放生物分子的不同特性。

MOF门控MS疫苗和PD-1阻断剂的联合免疫疗法

我们探索了使用MOF门控MS癌症疫苗的皮下(sc)给药和腹膜内(ip)注射抗PD-1 Ab的组合免疫疗法(图   56a,b;补充图   3133))。通过将E.G7-OVA癌细胞皮下注射到小鼠的右胁腹区域(C57BL / 6),然后将癌苗疫苗皮下注射到左胁腹区域,再腹膜内注射抗癌药物,建立了治疗性小鼠肿瘤模型。 -PD-1 Ab在肿瘤接种后第3、7、14和21天的剂量为每只小鼠0、20或200μg。由于随后的癌症免疫治疗是在不同的身体部位进行的,因此未在直接治疗的情况下将右翼上预先确定的肿瘤称为远处肿瘤。如表1所示,将小鼠分为九个治疗组  

图5:在治疗性小鼠模型中的抗肿瘤活性和肿瘤特异性免疫应答。
图5

一个(MS @ OVA的方案 MOF)@(聚IC MOF)制造。b将MOF门控的MS癌症疫苗与抗PD-1 Ab结合使用以刺激DCs细胞活化,增强癌症抗原-淋巴结和脾脏中特定T细胞的活性,释放免疫学破坏并抑制肿瘤生长的方案。c治疗时间表:向雌性C57Bl / 6J小鼠皮下注射2×10 5细胞-1小鼠E.G7-OVA细胞,以建立肿瘤。在肿瘤接种后的第3、7、14、21天,给小鼠皮下注射癌症疫苗并腹膜内注射抗PD-1Ab。连续监测肿瘤的生长。d皮下注射E.G7-OVA细胞后,小鼠的存活(左)和肿瘤体积(右)的Kaplan–Meier曲线(n  = 7只独立的动物;左,对数秩;右,双向ANOVA)。ef终点处脾细胞中四聚体+ CD8 + T细胞的群体(e)和代表性流式细胞仪图(fe中的数据n  = 4只独立动物,单因素方差分析,然后进行事后检验进行Tukey多重比较,p  <0.0001。所有数据(d,右图;e)均以平均值+ SD表示

图6:肿瘤部位的细胞因子分泌和OVA特异性细胞毒性CD8 + T细胞杀伤。
图6

a,b在终点处的肿瘤中的细胞因子(a,d,e,fn  = 4只独立的动物;b,c, n  = 5只独立的动物;单向方差分析,然后进行hoc测试后进行Tukey多重比较; IL-2 ,p  <0.0001)。c抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞测定的示意图。从小鼠的终点处获得脾细胞,并与CFSE染色的活E.G7-OVA癌细胞或健康的NIH3T3细胞以E / T = 10的比例共培养,并用ELISA法分析细胞毒性CD8 + T细胞对OVA 的特异性Ghost Dye™Violet 450染色和流式细胞仪。d来自不同小鼠的脾细胞针对E.G7-OVA癌细胞或健康NIH3T3细胞的代表性流式细胞仪图。e来自不同小鼠的脾细胞对E.G7-OVA癌细胞或健康的NIH3T3细胞的细胞毒性(n  = 3个独立样品,单向ANOVA,随后经过hokey测试的Tukey多重比较; E.G7-OVA,p  = 0.0002 )。所有数据(a,b,e)均表示为平均值+ SD

表MOF门控MS接种的组合免疫疗法和PD-1阻断1实验参数(图   56S31 - S34)。

MOF门控MS疫苗与低剂量PD-1阻断剂的结合可显着改善治疗性抗肿瘤作用。小鼠(MS @ OVA处理 MOF)@(聚IC MOF)加上IP抗PD-1(F组)显示出更高的存活率低剂量和更小的肿瘤体积比那些仅游离OVA处理(组b)中,自由OVA加上IP的抗PD-1(c组的低剂量),OVA MS加上IP的抗PD-1(组d的低剂量)和OVA /聚IC MS加上低剂量的腹膜内抗PD-1(e组)。更重要的是,小鼠(MS @ OVA处理 MOF)@(聚IC MOF)加低剂量的ip抗PD-1(f组)与使用游离OVA加常规和高剂量的ip抗PD-1(a组)治疗的肿瘤相比具有相似的肿瘤抑制作用。为了了解显着的抗肿瘤治疗作用的机制,我们分析了由治疗疫苗引发的T细胞群体(图   5e,f)。小鼠用(MS @ OVA MOF)@(聚IC MOF)加上IP抗PD-1的低剂量(组F)显著更高表明四聚体+ CD8 +群体的脾细胞中,比那些与游离OVA加上处理过的抗PD-1抗体(组a)中,只有游离OVA(b组),游离OVA加上IP的抗PD-1(C组)的低剂量,OVA的高剂量MS加上IP抗PD-1(组d)的低剂量,和OVA /聚IC MS加上IP抗PD-1(E组)的低剂量。的给药(MS @ OVA MOF)@(聚IC MOF)加上IP抗PD-1(F组)的低剂量刺激小鼠的肿瘤IL-2分泌。此外,将含有OVA和polyIC的MOF门控MS疫苗与高剂量的全身性抗PD-1 Ab一起使用,剂量为200μg/小鼠(补充图   3233)。小鼠(MS @ OVA处理 MOF)@(聚IC MOF)加上高剂量的ip抗PD-1(第i组)显示出比用游离OVA加大剂量的ip抗PD-1(第a组)更高的存活率和更小的肿瘤体积,只有游离OVA(b组),OVA MS加的IP抗PD-1(组g)的高剂量,和OVA /聚IC MS加上IP的抗PD-1(H组)的高剂量。小鼠用(MS @ OVA MOF)@(聚IC MOF)加上IP抗PD-1(组I)的高剂量显示最高的四聚体+ CD8 +在所有组中脾人口。

总体而言,MOF门控MS作为佐剂比无MOF的MS更有效地引发抗肿瘤免疫反应。有效的癌症疫苗佐剂应有助于将抗原递送至引流淋巴结,增强DC成熟和交叉呈递,并导致强大的CD8 + T细胞反应。在此,MOF门控MS有效地封装了癌症抗原和免疫增强剂,防止了它们的脱靶释放,并增强了其向APC和淋巴结的靶向递送,从而导致了肿瘤特异性CD8 +的增加。T人口,与没有MOF的MS相比。我们假设与MOF相关的pH响应关守特性有助于将高分子量抗原和免疫增强剂有效地递送到孔径高达几十纳米的MS中。

E.G7-OVA癌细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞测定

为了表征CD8 + T细胞对E.G7-OVA细胞的抗原特异性细胞杀伤活性,在终点收集小鼠脾细胞,并在体外用IL-2和OVA传代培养7天(图   6c–e,补充图   3335)。使用NIH3T3成纤维细胞和PC-12嗜铬细胞瘤细胞作为对照。从小鼠(MS @ OVA处理的脾细胞 MOF)@(聚IC MOF)加上低剂量的ip抗PD-1(f组)对表达OVA的E.G7-OVA淋巴瘤细胞的细胞毒性比用游离OVA和大剂量的ip抗PD- 1(A组),仅游离OVA(b组),游离OVA加上IP的抗PD-1(C组)的低剂量,OVA MS加上IP抗PD-1(组d)的低剂量和OVA /聚IC MS加上IP抗PD-1(E组)的低剂量。从小鼠(MS @ OVA处理的脾细胞 MOF)@(聚IC MOF)和高剂量的ip抗PD-1(第i组)在所有组中均显示出针对E.G7-OVA淋巴瘤的最高细胞毒性。相比之下,所有组的脾细胞对NIH3T3成纤维细胞和PC-12嗜铬细胞瘤细胞均表现出轻度的细胞毒性,而无显着差异。CD8 +细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是细胞介导的抗肿瘤免疫的主要效应细胞3134用(MS @ OVAinMOF)@(polyICinMOF)癌症疫苗免疫的小鼠脾脏中的CD8 +细胞毒性T淋巴细胞对表达OVA表位的E.G7-OVA淋巴瘤细胞具有更高的特异性杀伤能力(SIINFEKL)。

MOF门控MS的生物相容性

为了证实安全性,向健康的C57Bl / 6J小鼠皮下注射1 mg MS @ MOF或MOF,并进行血液生化和组织相容性分析(补充图   36)。生理盐水给药组用作对照。没有观察到MOF门控MS和MOF有明显的肝或肾毒性,丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)对肝功能,肌酐(CRE)和血尿素氮(BUN)对肾功能的影响表明。与生理盐水相比。生理盐水,MOF或MS @ MOF给予小鼠的肾脏,脾脏,心脏,肝脏和肺的组织学切片无明显差异,表明无明显组织毒性。

讨论区

癌症免疫日益认为是引起全身免疫应答和建立广谱治疗方案,适用于各种肿瘤类型的有希望的策略,因为它们旨在靶向免疫系统,而不是肿瘤本身1335基于癌症疫苗和免疫检查点封锁疗法之间协同作用的联合免疫疗法可以将免疫检查点封锁的剂量降低至1/10,同时保持有效性,同时将可能的免疫毒性和治疗费用降至最低。抑制肿瘤生长和激活抗肿瘤免疫的协同作用来自增强癌症抗原的免疫原性和激活抗肿瘤CD8 + 由于疫苗成分引起的T细胞反应,以及由于检查站封锁而引起的免疫抑制疾病的治疗。

可以将抗原,免疫增强剂和佐剂整合到一个带有pH开关的颗粒中,以用于局部施用的癌症疫苗,以实现将这些组分共递送至相同的APC,将组分的共定位和保留在淋巴结中,高效抗原交叉呈递,并同时防止其进入全身循环,抑制不希望的刺激的开始在血液或组织中,并提高安全性轮廓的癌抗原特异性T细胞应答的最大化3536这项研究的结果表明,MOF门控MS具有显着更高的能力,可促进APC在细胞内摄取癌抗原,将癌抗原传递至淋巴结,增强抗原交叉呈递,促进T细胞活化和细胞因子分泌。 ,而不是MS纳米佐剂。对于具有大孔和开放通道的MS纳米颗粒,它们提供了容纳癌症抗原和免疫增强剂的空间。但是,将分子加载的MS纳米粒子放入释放缓冲液或将其注入体内时,MS的开放式多孔结构将导致所加载组分的快速泄漏。得益于MOF作为网守的保护功能,MOF门控的MS将极大地防止封装的癌症抗原和免疫增强剂在注射部位的过早泄漏,因为MOF门控的MS在〜7.4的pH值下释放量很小或可忽略不计。MOF门控MS显示在中性环境中胶囊化的癌症抗原和免疫增强剂的缓慢释放以及在酸性环境中的快速释放,将极大地促进癌症抗原和免疫增强剂向关键APC的传递,APC的活化和向附近肿瘤的转运。排空淋巴结,将消化后的片段呈递给幼稚的T细胞,免疫细胞(例如CD4)的克隆扩增+和CD8 + T细胞,通过细胞因子分泌获得辅助功能,从而根除肿瘤细胞。

癌症疫苗和检查点抑制性抗体之间的协同作用会发生,以攻击癌细胞并实现针对肿瘤的有效治疗活性。全身性给予抗PD-1 Ab可以通过阻断免疫抑制信号来改变肿瘤的微环境。但是,检查站封锁癌症疗法仅在患者的肿瘤具有免疫原性时才发挥作用,这可能解释了临床试验中检查站封锁的低响应率(〜10–40%)。抗PD-1 Ab发挥其作用的前提条件是已经启动了癌症抗原特异性抗肿瘤免疫反应。因此,癌症疫苗的外部刺激对于增强肿瘤抗原的免疫原性,刺激抗肿瘤免疫力,增强CD4 +至关重要。和CD8 + T细胞群体,并促进Th1细胞因子的分泌。

当将疫苗接种和PD-1阻断剂结合使用时,使用封装了OVA和polyIC的MOF门控MS的疫苗接种大大降低了抗PD-1 Ab的全身剂量。在正常情况下,在健康的身体中,免疫系统可以识别癌症抗原并杀死癌细胞。但是,一旦体内出现肿瘤,肿瘤免疫抑制微环境就会阻碍免疫识别和癌症免疫周期的进程37由于癌症抗原的免疫原性较弱,因此产生了负面的调控途径和其他机制。使用封装了OVA和polyIC的MOF门控MS的疫苗接种有效触发了抗肿瘤免疫反应,同时,低剂量的抗PD-1 Ab给药会阻断免疫抑制途径。MOF门控MS癌症疫苗与抗PD-1检查点的协同作用使打破促发因子和抑制因子之间的免疫平衡,克服与免疫抑制性肿瘤微环境相关的活化能障碍和克服癌症变得更加容易-免疫设定点38然后,将重新启动癌症免疫周期,包括一系列步骤,包括通过APC捕获癌症抗原,将抗原呈递给T细胞,效应T细胞引发和激活,效应T细胞向肿瘤的转运,浸润。效应T细胞进入肿瘤床,通过T细胞识别癌细胞,杀死癌细胞,释放癌症抗原等37

结论

总之,由MOF门控的纳米佐剂制成的癌症疫苗与低剂量检查站封锁疗法相结合,有望用于癌症治疗。受到MOF对生物分子的卓越仿生矿化包封能力和MS优异的固有免疫整形特性的启发,我们制造了MOF门控的纳米佐剂,以将与免疫学相关的大分子靶向递送至引流淋巴结并导航抗肿瘤免疫力。MOF门控疫苗与全身性抗PD-1 Ab的联合给药可将抗PD-1 Ab的剂量成功降低至1/10,同时保持抗肿瘤效果。值得注意的是,MOF门控MS递送系统有望广泛应用于各种治疗剂,包括肽,核酸,分子免疫增强剂,

方法

理化特性

在用铂涂覆之后,使用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,JEOL)观察纳米佐剂,并使用透射电子显微镜(TEM,JEOL)观察纳米佐剂。通过动态光散射光度计(DLS-8000HAL,Otsuka Electronics)分析纳米助剂的流体动力学直径。使用粉末X射线衍射仪,使用CuKαX射线(RINT 2500型,Rigaku),分析纳米佐剂的相。使用Delta纳米C颗粒分析仪(美国贝克曼库尔特公司)通过将颗粒分散在无钙和镁的无磷酸盐缓冲盐水(PBS(-))中来分析纳米助剂的Zeta电位。氮气(N 2通过表面积和孔隙率分析仪(TriStar II,Micromeritics,America)测量纳米助剂的吸附-解吸等温线,然后计算BET比表面积和孔径分布。

纳米佐剂合成

在初步实验中,合成了MOF,MOF门控的MOF,MS和MOF门控的MS,如下所示。通过将80μL的Zn(NO 32 ·6H 2 O(Wako)溶液(×1.0,0.69 M),400μL的水和800μL的2-甲基咪唑(Wako)溶液(×1.0,3.13)混合来合成MOF。M)在冰中超声处理20分钟。将获得的产物离心,用超纯水洗涤,并分散在溶液中或冷冻干燥。通过将400μL的MOF核心悬浮液以6 mg / mL的浓度与80μL的Zn(NO 32 ·6H 2混合在水溶液中来合成MOF门控的MOFO溶液(×0.2,0.138 M;×0.4,0.276 M;×0.5,0.345 M)和800μL2-甲基咪唑溶液(×0.2,0.626 M;×0.4,1.252 M;×0.5,1.565 M)在冰上放置20分钟。将获得的产物离心,用水洗涤,并分散在溶液中或冷冻干燥。

使用软模板法合成MS 39通常,在70°C搅拌下将十六烷基三甲基对甲苯磺酸铵(CTAT,Sigma-Aldrich)和三乙醇胺(TEA,Sigma-Aldrich)添加到超纯水中,然后缓慢加入四乙氧基硅烷(TEOS,Wako,Japan)。将反应混合物的摩尔比为1.00 TEOS:0.06 CTAT:0.026 TEA:80h的2 O,分别。将反应混合物连续搅拌2小时以获得沉淀物。离心获得的产物,用超纯水/乙醇洗涤,干燥并在550℃下热处理5小时。通过混合400μLMS悬浮液(0.033 M; 0.100 M; 0.166 M),80μLZn(NO 32 ·6H 2合成MOF门控MSO溶液(×0.1,0.069 M;×0.3,0.207 M;×0.4,0.276 M;×0.5,0.345 M;×0.6,0.414 M)和800μL2-甲基咪唑溶液(×0.1,0.313 M;×0.3 ,0.939 M;×0.4、1.252 M;×0.5、1.565 M;×0.6、1.878 M)。然后,将产物离心,用水洗涤,并分散在溶液中或冷冻干燥。

将模型抗原和免疫增强剂封装到纳米佐剂中

在初步实验中,将作为模型抗原的卵清蛋白(OVA,Sigma-Aldrich)封装到MOF中,通过混合400μLOVA水溶液(1 mg / mL,5 mg / mL和25 mg / mL) MOF中制备OVA 将80μLZn(NO 32 ·6H 2 O溶液(×1.0,0.69 M)和800μL2-甲基咪唑溶液(×1.0,3.13 M)在冰中超声20分钟,然后离心,洗涤用水分散在溶液中或冷冻干燥。另外,使用400μL的polyIC水溶液(1 mg / mL,5 mg / mL和25 mg / mL)代替OVA水溶液将聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyIC,InvivoGen)作为免疫增强剂封装到MOF中。

在随后的实验中,具有和不具有包封生物分子的MOF门控MS的合成如下。通常,通过混合600μL含和不含OVA的MS水性悬浮液,80μLZn(NO 32 ·6H 2 O溶液(×0.2,0.138 M)和600μL 来合成具有和不具有OVA的MOF门控MS 将2-甲基咪唑溶液(×0.2,0.626 M)在冰中超声处理20分钟,然后离心,用水洗涤并分散在溶液中或冷冻干燥。将样品名为MS @(OVA 分别MOF)和MS @ MOF,。此外,MS @(铁蛋白 MOF)用铁蛋白代替OVA的相同的方法制备。然后,(MS @ OVA MOF)@(聚IC MOF),(MS @ OVA MOF)@(抗CTLA4 MOF)和(MS @ OVA MOF)@MOF通过混合MS的600μL制备@(OVA MOF具有和不具有聚IC或抗)水悬浮液-CTLA4、80μLZn(NO 32 ·6H 2 O溶液(×0.2,0.138 M)和600μL2-甲基咪唑溶液(×0.2,0.626 M)在冰中超声处理20分钟,然后离心,用水洗涤,分散在溶液中或冷冻干燥。

颗粒质量和生物分子数量的定量方法

MOF门控MS中MS和MOF的质量是通过测量合成反应之前和之后的平均重量来计算的,其中不包括MS本身的溶解度(n  = 3)。MOF的质量是通过测量合成反应前后的平均重量来计算的(n = 3)。使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories,Inc.)确定加样前后溶液中OVA,铁蛋白和抗CTLA4抗体的浓度。使用紫外可见分光光度计(V-550,JASCO)测量加载前后的polyIC浓度。通过以下公式分别计算生物分子(OVA,铁蛋白,polyIC和抗CTLA4等)的包封效率:生物分子包封效率=(初始生物分子浓度-包封后的生物分子浓度)/初始生物分子浓度×100%。在相同浓度的具有合成参数的2-甲基咪唑溶液中,可获得包括OVA,铁蛋白,抗CTLA4抗体和polyIC在内的生物分子标准溶液。

纳米佐剂的降解与生物分子的释放有关

合成具有和不具有封装OVA的MOF门控MS或MOF。在MS @ MOF和MS MOF:MOF:MS的最终质量比OVA在MS @(OVA MOF)是约2.4:1分别,:0.6和2.4:0.6。MOF的最终质量比:在OVA OVA MOF是约3:1。与此相反,OVA 的3 OVA质量比:1:MS通过混合OVA溶液和MS颗粒与MS制备。MS的降解,MS @ MOF,MOF,OVA MS,MS @(OVA MOF)和OVA 在37°C孵育后,定量分析袋装在透析膜袋中的乙酸盐缓冲液(pH = 5)或Tris-HCl缓冲液(pH = 7.4)中的MOF样品的颗粒/缓冲液比率为1 mg / mL通过使用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES:SPS7800,精工电子有限公司)测量Si和Zn。在乙酸盐缓冲液(pH = 5)或Tris-HCl缓冲液(pH = 7.4)中,OVA的释放在37°C下以3 mg / mL的颗粒与缓冲液比率确定。

所述MS @(聚IC MOF)和聚IC MOF样品通过方法相同,对于上述MS合成@(OVA MOF)和OVA MOF样品除了MS的质量比:MOF:聚IC和MOF: polyIC分别为2.4:0.6:0.5和3:0.5。所述聚IC 的约3聚IC质量比:0.5 MS通过混合聚IC溶液和MS颗粒与MS制备。在乙酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液中,在37°C下,颗粒与缓冲液的比率为1 mg / mL,确定了polyIC的释放。

此外,补充了10%血清的Tris-HCl缓冲液被用作第三种介质,以与乙酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液相同的方案测试与分子释放相关的纳米佐剂的降解。在血清溶液中,由于OVA和血清在光谱上有重叠,因此将铁蛋白用作模型生物分子。通过使用ICP-AES测定铁来定量分析铁蛋白的释放。使用StrandBriteTM绿色荧光RNA定量试剂盒(AAT Bioquest)测试了血清中polyIC的释放。

根据相应的实验参数,在醋酸盐缓冲液,Tris-HCl缓冲液或补充有10%血清的Tris-HCl缓冲液中获得用于释放实验的生物分子标准溶液,包括OVA,铁蛋白和polyIC。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

OVA加载nanoadjuvants,包括OVA MS,MS @(OVA MOF)和OVA MOF,分散在PBS( - )分别为200ng /μLOVA的最终浓度和800毫微克/微升的颗粒,。游离OVA用作对照。为了制备上清液样品,将装有OVA的纳米佐剂悬浮在PBS(-)中1 h,然后以13,000 rpm离心10分钟。然后,将装有OVA的纳米佐剂或上清液样品与2×SDS-PAGE样品缓冲液混合,在50°C下温育10分钟,装入凝胶中,并在30 mA下与1×Tris-甘氨酸一起电泳70分钟-SDS缓冲区根据制造商的说明。通过用Rapid Stain考马斯亮蓝试剂盒染色使凝胶可视化。

体外树突状细胞的细胞摄取和激活

骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)从小鼠股骨40获得去除红细胞,IA / IE和藻红蛋白偶联的抗CD4,CD8表达细胞后,将左侧细胞在RPMI 1640(Gibco)中培养,该溶液含有10%胎牛血清和20 ng / mL粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( GM-CSF,生物试剂)。在第9天收集BMDC。总共将2×10 5个 BMDC在玻璃底盘或96孔板中预培养6小时。Nanoadjuvants使用OVA或荧光素-缀合的OVA(FOVA,Life Technologies)中,在那里他们OVA制备 MS,MS @(OVA MOF),OVA MOF,FOVA MS,MS @(FOVA MOF)和FOVA 将MOF以30μg/ mL的颗粒浓度和5μg/ mL的OVA或fOVA浓度添加到BMDCs培养基中。过夜培养后,将BMDCs用Hoechst(Thermo Fisher)染色以检查细胞核,并通过共聚焦激光显微镜(Leica)进行观察。使用图像J软件计算细胞摄取荧光图像的定量分析。使用小鼠ELISA试剂盒(BD Biosciences)根据制造商的说明书定量上清液中的TNF-α和IL-1β。为了进一步措施活化的BMDC的,2×10 6的BMDC在24孔板共培养与游离OVA,OVA MS,MS @(OVA MOF)和OVA 颗粒浓度分别为30μg/ mL和OVA浓度为5μg/ mL的MOF。培养3天后,使用胰蛋白酶-EDTA收集BMDC,用1/100稀释的抗CD16 / CD32 Ab(2.4G2,BioLegend)封闭,并用结合至H的抗小鼠OVA257-264(SIINFEKL)肽染色-2Kb抗体,抗小鼠MHC II(IA / IE)抗体,抗小鼠CD80抗体,抗小鼠CD40抗体和抗小鼠CD197(CCR7)Ab(BioLegend),稀释度为1/50。使用FACSAria(BD Bioscience,美国)进行流式细胞术。对于所有流式细胞术实验,每个样品收集1–300万个细胞进行染色。其中,每个样品至少有10–5万个细胞用于流式细胞仪分析。使用Flowjo软件分析流式细胞仪数据。

另外,为了比较fOVA或OVA的吸附与包封之间的差异,制备了通过共沉淀(fFA-en)吸附fOVA或OVA的MOF(MOF-ad)和将fOVA或OVA进行包封的MOF,并将其添加到BMDC的培养浓度为25μg/ mL,OVA或F-OVA浓度为5μg/ mL。

抗原保留在注射部位和体内颗粒分布

亚历氟647-缀合的OVA(A647-OVA,分子探针)或MS @(A647-OVA MOF)注射到雌性C57BL / 6J小鼠的侧腹(Ñ = 3,每组;CLEA Inc.)在100μL盐水中的A647-OVA剂量为100μg/小鼠,颗粒剂量为600μg/小鼠。在6小时,1天和3天,使用IVIS成像系统观察小鼠,激发波长为580nm,发射波长为680nm。为了清楚地看到纳米粒子的身体分布,在第1天收集小鼠的主要器官(附近的引流淋巴结,脾脏,肺,心脏,肾脏和肝脏)并使用IVIS成像系统进行观察。数据。此外,ICP-AES测量用于定量分析附近引流淋巴结中纳米粒子(Si和Zn含量)的靶向分布。

APC介导的体内淋巴结递送和OVA交叉呈递

雌性C57BL / 6J小鼠(3只小鼠,每个基团; CLEA公司制)通过注射FOVA,FOVA免疫 MS,MS @(FOVA MOF)和FOVA 分别以600μg/小鼠和100μg/小鼠的颗粒和fOVA剂量将MOF皮下植入左胁。16小时后将免疫的小鼠杀死,并收集附近的引流淋巴结。制备淋巴结的低温恒温器切片,用DAPI染色,并使用荧光显微镜(Olympus BX51)和高灵敏度相机(Olympus DP74)进行观察。在相同的参数设置下获取荧光图像。使用image J软件计算荧光图像的定量分析。此外,收集引流淋巴结,将其研磨,涡旋并通过40μm细胞过滤器过滤以获得单细胞悬液。用含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS(-)洗涤单细胞悬液。通过用稀释度为1/100的抗CD16 / CD32 Ab(2.4G2,BioLegend)封闭细胞,可以防止非特异性染色。用抗小鼠CD11c Ab和结合至H-2Kb Ab(BioLegend)的抗小鼠OVA257-264(SIINFEKL)肽以1/50稀释液将细胞染色30分钟。使用FACSAria(BD Bioscience,美国)进行流式细胞术。

预防性癌症免疫疗法

将二十八只雌性C57Bl / 6J小鼠(7只小鼠/组; 6周龄,CLEA Inc.)分为以下四组:1#生理盐水组; 1#生理盐水组; 3#小鼠。2#游离OVA-抗CTLA4组(OVA,100μg/小鼠;抗CTLA4 Ab,Bio X Cell,20μg/小鼠); 3#(OVA MOF)@(ANIT-CTLA4 MOF)组(OVA,100微克/小鼠;抗CTLA4抗体,20微克/小鼠; MOF,600微克/小鼠); 和4#(MS @ OVA MOF)@(抗CTLA4 MOF)(OVA,100微克/小鼠;抗CTLA4抗体,20微克/小鼠; MS @ MOF,600微克/小鼠)。在第0、3和10天,将100μL盐水中的每个受试者皮下注射到小鼠的左胁腹。在第14天,用活的E.G7-OVA细胞攻击小鼠(5×10 5细胞,小鼠-1)皮下插入右侧。每周监测小鼠右侧腹的肿瘤生长3次,并持续数周。根据肿瘤大小<15 mm统计计算存活率。通过1/2×最长尺寸×垂直尺寸2来计算肿瘤体积

联合癌症免疫疗法

首先,将活的E.G7-OVA细胞(2×10 5细胞小鼠-1)皮下注射到六十三只雌性C57BL / 6小鼠(7只小鼠/组; 6周龄,CLEA Inc.)的右胁腹中。在肿瘤接种后第3、7、14、21天,将小鼠分为以下9组,并向以下受试者注射100μL盐水:游离OVA(100μg/小鼠)和高剂量的ip anti-PD组-1 Ab(Bio X Cell,200μg/小鼠); b组仅游离OVA(100μg/小鼠);c组中游离OVA(100μg/小鼠)加上低剂量的ip抗PD-1 Ab(20μg/小鼠); d组的MS吸收的OVA MS的OVA:OVA,100μg/小鼠; MS,600μg/小鼠)加上低剂量的ip抗PD-1 Ab抗体(20μg/小鼠);OVA / polyIC吸附在MS上(OVA / polyIC吸附在MS MS:OVA,100μg/小鼠;polyIC,每只小鼠100μg;MS,600μg/小鼠),在e组中加低剂量的ip抗PD-1 Ab(20μg/小鼠);(MS @ OVA MOF)@(聚IC MOF)(OVA,100微克/小鼠;聚IC,100微克/小鼠; MS @ MOF颗粒,600微克/小鼠)加上IP抗PD-1抗体的低剂量(20微克/鼠)F组,OVA MS(OVA,100微克/小鼠; MS,600微克/小鼠)加上IP抗PD-1抗体(200微克/小鼠)在组g的高剂量; OVA /聚IC MS(OVA,100微克/小鼠;聚IC,100微克/小鼠; MS,600微克/小鼠)加IP抗PD-1抗体(200微克/小鼠)在组h的高剂量; (MS @ OVA MOF)@(聚IC MOF)(OVA,100μg/小鼠; polyIC,100μg/小鼠; MS @ MOF颗粒,600μg/小鼠)进入左胁腹,再加上大剂量的ip抗PD-1 Ab(200μg/小鼠)在第一组 监测小鼠右侧腹的肿瘤生长数周。根据肿瘤大小<15 mm计算存活率。通过1/2×最长尺寸×垂直尺寸2来计算肿瘤体积

肿瘤部位和脾脏中的细胞因子含量

在预防和联合癌症免疫治疗的终点,切除肿瘤部位和脾脏并用T-PER组织蛋白提取试剂(Thermo Fisher Scientific)裂解,并使用小鼠ELISA试剂盒(BD)定量肿瘤部位的细胞因子数量。生物科学)根据制造商的说明。

抗原特异性T细胞群体分析

在预防和联合癌症免疫治疗的终点,从脾脏中收集脾细胞,进行研磨,涡旋并通过40μm细胞过滤器过滤以获得单细胞悬液。1/100稀释度的抗CD16 / CD32抗体(2.4G2,Biolegend)用于防止非特异性染色。用1/50稀释度的抗小鼠CD8αAb(BioLegend)和抗小鼠T-Select H-2Kb OVA Tetramer-SIINFEKL Ab(MBL)将细胞染色30分钟。然后,用1/50稀释的抗小鼠IFN-γAb(BioLegend)对细胞内细胞因子进行染色。使用FACSAria细胞流式细胞仪(BD Biosciences)对细胞悬液进行流式细胞术。

E.G7-OVA癌细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞测定

在组合癌症免疫疗法的终点,杀死所有组的小鼠以收获脾细胞。在脾细胞用40 ng / mL小鼠IL-2和20μg/ mL OVA继代培养7天后,将脾细胞与5-(和-6)-羧荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE,Dojindo)-染色的活E.G7共培养-OVA癌细胞和NIH3T3成纤维细胞的效应细胞/靶细胞比例分别为10。另外,将来自f组的小鼠以效应细胞/靶细胞比率分别为0、5、10和20的比率共培养CFSE-染色的活E.G7-OVA癌细胞和PC-12癌细胞。然后24小时后用Ghost Dye TM紫罗兰色450(Bay bioscience)将细胞染色。使用FACSAria细胞流式细胞仪(BD Biosciences)分析了脾细胞对E.G7-OVA癌细胞,NIH3T3成纤维细胞和PC-12癌细胞的细胞毒性,分别。细胞毒性通过下式计算:细胞毒性=(总死亡靶细胞-自发死亡靶细胞)/(总靶细胞-自发死亡靶细胞)×100%。

纳米佐剂的生物相容性

为了检查体内安全性,将盐水,MOF门控的MS和MS(在100μL盐水中为1 mg /小鼠)皮下注射到C57 / BL6J小鼠(每组5只小鼠; CLEA Inc.)的左胁皮下。3天后对小鼠实施安乐死,并收集血液用于血液血液学分析。收集器官,包括肾脏,脾脏,心脏,肝脏和肺,固定在10%中性福尔马林缓冲溶液(Wako)中,包埋在石蜡中,并用苏木精和曙红染色。

统计和可重复性

差异的统计显着性通过事后检验采用对数秩检验,Student's t检验或ANOVA与Tukey多重比较进行计算。p的<0.05值被认为是统计学显著。每个实验至少重复两次,结果相似。

道德问题

日本国家先进工业科学技术研究院(AIST)伦理委员会批准了动物实验。所有动物实验和喂养均按照日本AIST伦理委员会的指导进行。

报告摘要

与本文链接的《自然研究报告摘要》中提供了有关研究设计的更多信息  

资料可用性

无花果的源数据。 2345和 6和补充图。 202223252627283032333536被提供作为一个源数据文件。所有其他相关数据都可以在本文的补充信息中找到,也可以根据合理的要求从通讯作者处获得。 本文提供了源数据




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