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Western blot实验的一点总结

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发表时间:2020-07-30 11:58作者:武汉新启迪生物Xinqidibio来源:www.qidibio.com

Western blot实验的一点总结

一、实验过程中需要注意的问题

①蛋白样品的提取及蛋白含量的检测

蛋白样品的提取咱们完全是按照试剂盒说明书来做的,步骤没有什么讲的,但是因为蛋白样品的好坏直接决定了是否能做出来蛋白条带,这就好比盖房子所需要的砖头一样,一定要务必认真。

②仪器准备

清洗玻璃板:玻璃板的正确拿法应该是拿住玻璃板的左右两侧不要用手拿上下两端,避免手套上面的脏东西顺着水流流到玻璃板上,玻璃板请一定务必清洗干净,不干净的玻璃板上面的残留物可能会影响凝胶之间的化学反应,导致胶出现问题,对后面的结果影响很大。

玻璃板放置:玻璃板底部对齐,垂直放入夹子中间加紧,高的在后,矮的在前。

③凝胶配置

根据蛋白分子量的大小选择合适浓度的分离胶,可参考凝胶配置试剂盒中说明书或者参考别人的文献。配胶的APS需要在4度冰箱保存。注意配胶的时候胶一定一定要混匀,配胶的试剂中APS与TEMED是促凝剂,所以在加促凝剂之前先把其他组分混匀,可用*吹打也可用手腕去甩,向左甩n次再向右甩n次,或者用咱们实验室的混匀的那个仪器混匀,名字我给忘了,那个效果好产生的气泡很少而且节省人力。。。

④将配置好的分离胶沿着玻璃板一侧缓慢打入玻璃板中,这个时候不用担心打入气泡,灌入合适量的分离胶之后,加入适当剂量的ddWater或者异丙醇封胶(加入封胶试剂量没有规定,盖住整个分离胶胶面即可)

⑤上样

A. marker孔加入5微升,其余蛋白孔上样10微升左右,不要加的太多,这个后面会做说明。

B. 电泳仪及转膜仪请务必确定正负极是否对准确,不要犯低级错误。

⑥电泳

这个没有具体的时间限制,只要分子量最小的蛋白跑到胶的底部即可。在电泳过程中是否需要进行压胶还是直接恒压跑到底这个问题后面说明。电泳开始的时候开制冰机制冰,为后面的转膜做准备。

⑦转膜

A. 电泳快结束的时候就可以配置转膜液(转膜液室温20-30度不宜放过长时间,几天内用可以室温放置,如果时间太长可放入4度冰箱保存)

B. 根据自己的蛋白位置选择合适的位置切胶,切胶过程中保持胶的湿润(用蒸馏水不定时润湿),因为胶一旦干了脆性增强,很容易断。

C. 根据胶的大小选择合适大小的膜,膜和胶相同大小或者略小于胶,并且胶面和膜之间不能有气泡,大多数人认为如果膜大于胶会使得转膜过程中胶面短路,一是使得局部的蛋白不能转到膜上去,二是短路会使得局部温度过高(热量=U2/R*t)凝胶受热变形,转到膜上的蛋白歪七扭八,但是丁香园里面有大神说过气泡对于转膜影响不大,我没试验过。。

D. 胶,膜,滤纸,海绵放置成三明治结构,一旦放好不要乱动,否则对齐的胶和膜之间位置会有偏移。

选择合适的转膜时间进行转膜,至于转膜是选择横流还是恒压后面详细赘述,整个转膜过程,转膜仪需放置在冰水混合物中进行。

⑧抗原抗体反应

A. 丽春红染色??(是否需要丽春红染色以及什么情况下需要丽春红染色后面介绍)

B. 剪膜:根据自己的蛋白位置进行剪切

C. 洗膜   5min/3次

D. 封闭   选择适当的封闭液进行封闭(脱脂奶粉或者牛血清白蛋白)封闭多长时间?这个后面介绍

E. 一抗过夜孵育(一抗稀释比例根据说明书和别人的文献进行选择,是选择普通的一抗稀释液还是抗体公司推荐的抗体稀释液?这个后面介绍)

F. 洗膜   5min/3次

G. 二抗孵育 室温一小时

H. 洗膜   5-10min/3次

⑨ECL发光成像

   ECL发光液A液与B液1:1混合,将发光液滴到膜上曝光观察,若是对同一张膜进行其他蛋白曝光处理,可用一抗二抗洗脱液洗脱后重新一抗二抗孵育处理,若是对同一蛋白进行重新曝光则不需要。


二、实验过程中的那些问题

1. 关于上样的问题

A.上样量   个人认为上样量为能曝光出来完美的内参就刚好合适(内参不会太细,也不会连在一起),那么在目的蛋白出不来的情况下是否需要提高上样量来增加目的蛋白曝光出来的可能性,个人认为这是下下策,固然,增加上样量可以提高全蛋白的整体含量,但是最多也就是几倍的样子,相比于抗原抗体之间10的N次方倍的反应关系来说,几倍作用有点小。所以,增加上样量是解决目的蛋白曝光不出来的最后解决办法。这个时候就要注意注意缩短内参的曝光时间,以免曝光时间过长,内参条带连在一起。必要时候内参可以和目的蛋白条带分开曝光。如图a就是比较好看的内参,图b内参连在一起就不好了。

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B.泳道里面加蛋白样品的时候,*头放在泳道正中间,*头打出样品的速度要慢,否则蛋白样品很容易不均匀,条带粗细不均匀,如下图红色框内条带,出现这种情况的原因还有可能是抗体敷的不均匀或者转膜的时候最右边的蛋白和其他地方的蛋白相比转的不充分。

 

C.电泳的时候可以在最两侧上样的泳道旁边加上样缓冲液,咱们园里面大神说是不加的话,会造成两侧的蛋白条带略宽于中间的条带,我发现真的是这样,倒是加了上样缓冲液之后会不会改善,我没有发现有改善,可能是我操作的问题,欢迎其他人验证。见下图第一个没有两侧没有加缓冲液,两侧比中间宽,但是不太明显,第二个两侧加了缓冲液,两侧还是比中间宽一点,但是因为只验证了一次,所以说服力不大。

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下图为验证实验条带

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2. 关于电泳过程是否需要压胶

个人觉得如果上样量不大即10微升左右完全不需要压胶,蛋白条带也会很齐,如果上样量很大,还是压一下比较好,理论上来说,压胶的目的是在低电压的作用下,让各个泳道里面的蛋白样品在进入分离胶之前浓缩到一起也就是在一条直线上,上样体积小的时候,蛋白样品本身就在一条直线上,所以不需要压胶,我的上样体积一直是10微升,电泳过程中没有压过胶,也一直很齐,参考问题1a的图片。

3. 电泳的时间是否需要确定

不需要,电泳的目的是为了让不同分子量的蛋白分开,只要分开你的目的就达到了,至于为什么要让上样缓冲液里面的溴酚蓝跑到最下面,这是为了让不同分子量的蛋白在胶上分的最开,便于剪膜等操作。

4. 电泳液的回收问题

垂直电泳槽里面的电泳液不能回收,外槽的电泳液可以重复多次利用,我一般是用到回收的电泳液里面长毛的时候就不用了。。。。。但是注意,垂直电泳槽里面的电泳液每次都用新的电泳液,不要用回收的。。。下面是度娘的关于电泳液的作用

缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应,正极发生的是氧化反应(4OH--4e->2H2O+O2),负极发生的是还原反应(4H++4e->2H2),长时间的电泳将使正极变酸,负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力,是溶液两极的pH保持基本不变。 电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性,以利于DNA分子的迁移,例如,一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子,Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢;太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。 电泳缓冲液还有一个组分是EDTA,加入浓度为1-2mmol/L,目的是螯合Mg2+ 等离子,防止电泳时激活 DNA酶,此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。 TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量(TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量),且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%,电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果,此外,回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小,长时间电泳(如过夜)不可选用,除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 TBE的特点是缓冲能力强,长时间电泳时可选用TBE,并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用,并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低,所以不宜在回收电泳中使用。 TPE的缓冲能力也较强,但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出,所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。

5. 关于转膜是用恒流还是恒压的问题

个人做实验的过程中觉得恒流和恒压都可以,如果选择恒流,转膜过程中由于膜通透性降低,电阻持续增高,电压持续增高,转膜效率逐渐增高,电压会变化,但是缓冲液中带电粒子运动稳定,有利于转出高质量的膜.如果选择恒压,转膜过程中由于膜通透性降低,电阻持续增高,电流持续降低,转膜的效率逐渐降低,可以通过增加转膜时间和电压来改变这一劣势,但是根据公式(热量=U2/R*t)来看,如果选择恒压,电泳过程中产热是逐渐降低的,那么对胶的影响会小一些。(I=U/R),所以转膜是选择恒流还是恒压是仁者见仁智者见智的问题,那么就都可以选择。下面的两个条带是分别选择恒流和恒压做出来的条带,其他条件基本相同,选择的恒压是之前我做另外一个蛋白的时候的电压和时间,因为这两个蛋白的分子量比较接近,选择的恒流是一个师姐做的另外一个蛋白的电流,选择这个电流的原因也是和目的蛋白的分子量比较接近,都可以出结果,那么是否可以说明在做一个蛋白的时候,只要按照分子量大小差不多的蛋白转膜条件,就不会有大的问题???这个问题还没有解决,,,,,大家自行忽略条带上的其他问题,做验证性实验,改变了很多之前的条件,就成了这个丑样子了,想哭。。。

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6关于封闭的问题

A. 封闭时间

我一般是封闭30min,最短封闭过20min,背景有点脏,最长时间封闭过60min,效果和30min差不多。下图两个蛋白条带分别是封闭20min和70min曝光出来的结果,背景差不多一样脏。之所以背景这么脏的原因我觉得是因为抗体稀释比例大幅度下降,由1:1000变成1:500,这就是前面提到过的抗原抗体的反应是10的n次方的灵敏性,改变它比改变封闭时间效果姚更明显。所以个人觉的封闭30Min就可以了,我们要学会节省时间。

3.png

下图是用软件处理过的上面的图片,所以学会图片处理真的非常非常重要,往往可以让不好的结果变得还可以看,因为这个蛋白条带本身就不好看,所以我也改不动了。。。。。

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同样下图是封闭30min,抗体1:1000稀释没有处理过的图,结果就还行。

1.pngimg         


7. 关于抗体孵育的问题

A.抗体孵育时间12-18小时最好,我一般也是这个时间,也孵育过20h+,也能出结果,效果也还行,所以自己的蛋白我觉得首先可以尝试12-18h。

B. 抗体稀释比例

首先根据自己的抗体说明书选择适当的抗体稀释比例,然后后面再根据具体的结果在做调整,如果目的蛋白曝光了很长时间颜色还是很浅,就可以降低抗体稀释比例。

C. 抗体稀释液的选择

       如果蛋白条带很容易出来,那么无所谓选择普通型的抗体稀释液或者推荐的抗体稀释液,如果蛋白条带不好出来,那么就用推荐的抗体稀释液,这个抗体说明书上会有,不同的抗体推荐的稀释液可能不同,因为合适的抗体稀释液可以最大程度的激发抗体的活性,使得抗原抗体的结合更为充分

2. ECL显影的问题

   A.如果在曝光过程中出现下面情况,就是条带的颜色很深,但是条带中间出现了白色的区域,那么就在空白区域继续加显影液重新曝光。原因是因为白色区域蛋白浓度过高,会使得和它结合的显影液瞬间氧化,失去显影能力,大概就是这么个意思,我没遇到这种情况,下面的图中间的白色也是自己做出来的。大家理解其中的意思就可以了。

A. 如果条带连在一起

   增加抗体稀释比例,减少上样量

B. 如果条带出不来

首先考虑降低抗体稀释比例,改用推荐的抗体稀释液。增加上样量是下下策,上文已经说过,和10n 的抗原抗体反应比较,增加上样量仅仅只能增加几倍,影响不是很大,反而会使得内参条带连在一起,如果增加了上样量,那么可以适当增加内参抗体的稀释比例和曝光时间。

1. 是否选择丽春红染色的问题

我们必须明白的是丽春红染色是非特异性的,那也就是说丽春红会染出来很多条带而不是仅仅只有你的目的蛋白条带,况且就算是丽春红染出来了条带,那也不能说明就是你的目的蛋白,因为是非特异性的。那么,丽春红应该在什么时候用呢?①曝光出不来任何条带,用它来确定你的蛋白样品是否完全降解了②要做的几个目的蛋白分子量接近,这个时候你需要确定它的具体位置,以免把其中的哪个目的蛋白剪掉了ƒ用来确定你的目的蛋白是否位置是否改变不在应该在的位置,因为目的蛋白可能存在对应的单聚体或者多聚体或者蛋白构象发生改变。

总之,Western blot 实验过程虽然不复杂,但是步骤较多,每一步实验都需要仔细认真,否则一步一步的失误加起来最终会放大失误,导致结果出不来,多利用身边的资源,多交流,总会有完美的结果。


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